Τι είναι η φυγοκέντρηση; Ορισμός και αρχή της μεθόδου. Προπαρασκευαστική φυγοκέντρηση Η φυγοκέντρηση στη βιολογική μελέτη των κυττάρων

13.02.2024

Διαβάστε επίσης

Λογιστικό πρόγραμμα υπολογιστή για σημείο συλλογής παλιοσίδερων

Διαδικασία χρήσης KPS. Πώς να εισάγετε ένα νέο KPS; Νέο CPS σε ίδρυμα προϋπολογισμού

Κανονισμοί προϋπολογισμού Κανονισμοί προϋπολογισμού

Πώς λογίζονται τα πετρελαιοειδή στα πρατήρια καυσίμων;

Το γενεαλογικό δέντρο του Στάλιν Το μυστικό της οικογένειας του ηγέτη

Διάλεξη Νο. 3.

Αριθμός ωρών: 2

ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

1. Μικροσκόπιο φωτός

2. Ηλεκτρονική μικροσκοπία, σελπλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Τύποι ηλεκτρονικής μικροσκοπίας

Τα κύτταρα είναι πολύ μικρά σε μέγεθος και ταυτόχρονα πολύπλοκα στη δομή. Επομένως, για να μελετήσουμε επιτυχώς τη δομή και τη λειτουργία ενός κυττάρου, είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε και να κατακτούμε τις κατάλληλες πειραματικές μεθόδους.

Στο πρώτο στάδιο της ανάπτυξης της κυτταρολογίας, ο μόνος τρόπος για τη μελέτη των κυττάρων ήταν μικροσκοπία φωτός.

Μικροσκόπιοείναι μια συσκευή που σας επιτρέπει να αποκτήσετε μια μεγεθυμένη εικόνα μικρών αντικειμένων που δεν είναι ορατά με γυμνό μάτι. Οι ακόλουθες μονάδες μήκους χρησιμοποιούνται συνήθως στη μικροσκοπία:

μικρόμετρο (1 μm – 10 -6 m);

νανόμετρο (1 nm – 10 -9 m);

angstrom (1Å – 10 -10 m).

Υπάρχουν μικροσκοπία φωτός και ηλεκτρονίων. Ένα μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιεί φως για να παράγει μια μεγεθυμένη εικόνα, ενώ ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί ένα ρεύμα ηλεκτρονίων. Η ποιότητα της εικόνας καθορίζεται από την ανάλυση του μικροσκοπίου. Η ανάλυση είναι η μικρότερη απόσταση στην οποία η οπτική του μικροσκοπίου μπορεί να διακρίνει χωριστά δύο στενά απέχοντα σημεία. Ανάλυσητο ανθρώπινο μάτι είναι περίπου 100 μικρά. Αυτό σημαίνει ότι με γυμνό μάτι, σε απόσταση 25 cm, ένας παρατηρητής με μέση οπτική οξύτητα μπορεί να διακρίνει το ένα σημείο από το άλλο, εάν αυτά απέχουν τουλάχιστον 100 μm. Εάν τα εν λόγω σημεία απέχουν λιγότερο από 100 μm μεταξύ τους, φαίνεται να είναι ένα θολό σημείο. Το καλύτερο σύγχρονο μικροσκόπιο φωτός καθιστά δυνατή την εξέταση δομών με απόσταση μεταξύ στοιχείων περίπου 0,25 microns, ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο - περίπου 1,5 A.

Μικροσκόπιο φωτός είναι ένα σύνολο μεθόδων για την παρατήρηση μικροαντικειμένων χρησιμοποιώντας διάφορα οπτικά μικροσκόπια. Αυτές οι μέθοδοι εξαρτώνται σημαντικά από τον τύπο του φακού μικροσκοπίου, τις βοηθητικές του συσκευές, τον τύπο του μικροαντικειμένου και τη μέθοδο προετοιμασίας του για παρατήρηση, καθώς και από τη φύση του φωτισμού του κατά την παρατήρηση. Η ανάλυση ενός μικροσκοπίου φωτός περιορίζεται από διαστάσεις συγκρίσιμες με το μήκος κύματος του φωτός (0,4–0,7 μm για το ορατό φως). Ωστόσο, πολλά στοιχεία της κυτταρικής δομής είναι πολύ μικρότερα σε μέγεθος. Επιπλέον, όταν χρησιμοποιείται ένα συμβατικό μικροσκόπιο φωτός, οι περισσότερες δομές ενός ζωντανού κυττάρου είναι οπτικά άδειο.Οι οπτικά κενές δομές είναι εκείνες που είναι διαφανείς και σχεδόν δεν διαφέρουν σε δείκτη διάθλασης από το περιβάλλον τους. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για τον εντοπισμό τέτοιων δομών. στερέωσηΚαι χρωστικόςυλικό.

Στερέωσηείναι μια θεραπεία που διακόπτει γρήγορα τις ζωτικές διαδικασίες του κυττάρου και, στο μέτρο του δυνατού, διατηρεί αναλλοίωτη τη δομή των κυττάρων και των ιστών. Μετά τη στερέωση, τα κύτταρα γίνονται διαπερατά στις βαφές, η θέση σταθεροποιείται και η δομή των μακρομορίων σταθεροποιείται.

Χρωστικόςχρησιμοποιείται για την οπτική διαφοροποίηση των κυτταρικών δομών, καθώς και σε κυτταροχημικές μελέτες για τον εντοπισμό του εντοπισμού χημικών ενώσεων. Για παράδειγμα, οι βασικές βαφές (αιματοξυλίνη) έχουν συγγένεια με το πυρηνικό περιεχόμενο, ενώ οι όξινες βαφές (ηωσίνη) βάφουν το κυτταρόπλασμα. Χρησιμοποιείται για τη μελέτη των ζωντανών κυττάρων ζωτικής σημασίας (ισόβια) βαφές. Οι ζωτικές βαφές διεισδύουν στα ζωντανά κύτταρα σχετικά εύκολα και λερώνουν ορισμένες δομές χωρίς να τις καταστρέφουν. Ωστόσο, οι ζωτικές βαφές δεν είναι εντελώς ακίνδυνες για το κύτταρο και μετά από παρατεταμένη έκθεση οδηγούν στο θάνατό του. Οι ζωτικές βαφές περιλαμβάνουν ουδέτερο κόκκινο(για τη χρώση του κυτταροπλάσματος), μπλε του μεθυλενίου(χρώση του συμπλέγματος Golgi) κ.λπ. Χρησιμοποιώντας ζωτικές χρωστικές, κατέστη δυνατό να αποδειχθεί η ύπαρξη ορισμένων κυτταρικών οργανιδίων, τα οποία προηγουμένως θεωρούνταν τεχνουργήματα.

Τεχνούργημα- μια αλλαγή που συμβαίνει κατά την προετοιμασία του φαρμάκου.

Πριν από τη δοκιμή, κύτταρα ή κομμάτια ιστού συνήθως χύνονται σε λιωμένη παραφίνη ή σε ειδική ρητίνη. Το μέσο που χρησιμοποιείται για τη χύτευση ψύχεται ή πολυμερίζεται. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα ένα συμπαγές μπλοκ, το οποίο κόβεται σε πολύ λεπτά τμήματα χρησιμοποιώντας μικροτόμο. Τυπικά, το πάχος των τομών για μικροσκοπία φωτός είναι 1-10 μm. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η βλάβη σε έναν αριθμό κυτταρικών δομών. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται η μέθοδος προετοιμασίας τμημάτων με γρήγορη κατάψυξη. Ο κατεψυγμένος ιστός κόβεται σε ειδικό μικροτόμο (κρυότομο) εξοπλισμένο με ψυχρό θάλαμο (κρυοστάτη).

Εκτός από τη συμβατική μικροσκοπία φωτός, τα κύτταρα μελετώνται χρησιμοποιώντας μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσης, φθορισμού και ορισμένων άλλων τύπων μικροσκοπίας φωτός.

Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου. Σε αντίθεση με ένα συμβατικό μικροσκόπιο, ένα μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου είναι εξοπλισμένο με ειδικό συμπυκνωτή. Ο συμπυκνωτής έχει ένα σκούρο διάφραγμα που δεν μεταδίδει φως στο κέντρο του οπτικού πεδίου, έτσι ώστε το αντικείμενο να φωτίζεται από μια λοξή δέσμη. Σε αυτή την περίπτωση, μόνο οι ακτίνες που ανακλώνται και διασκορπίζονται από την επιφάνεια του αντικειμένου εισέρχονται στον φακό του μικροσκοπίου, γεγονός που αυξάνει την αντίθεση ορισμένων δομών και τις κάνει ορατές. Το μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου χρησιμοποιείται για την παρατήρηση ενός αριθμού δομών σε ένα ζωντανό κύτταρο. Συγκεκριμένα, η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συχνότητας της βλάβης των ακροσωμάτων στα σπερματοζωάρια των ζώων εκτροφής.

Μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης σχεδιάστηκε από τον Fritz Zernike το 1932. Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης είναι μια εξαιρετική μέθοδος για ενδοβιολογική παρατήρηση των κυττάρων. Χρησιμοποιείται για τη μελέτη πολλών κυτταρικών οργανιδίων και χρωμοσωμάτων κατά τη διαίρεση. Ο συμπυκνωτής ενός μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης έχει ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα μέσω του οποίου το φως διέρχεται με τη μορφή κοίλου κώνου και οι υπόλοιπες ακτίνες απορροφώνται. Ο φακός περιέχει μια πλάκα φάσης, η οποία είναι ένας διαφανής δίσκος με μια εσοχή. Το σχήμα και το μέγεθος της εγκοπής ταιριάζει με την άμεση εικόνα του δακτυλιοειδούς διαφράγματος. Όταν ένα αντικείμενο τοποθετείται μεταξύ του συμπυκνωτή και του φακού στο πίσω εστιακό επίπεδο του φακού, εκτός από την άμεση εικόνα, εμφανίζονται αρκετές επικαλυπτόμενες εικόνες περίθλασης του διαφράγματος. Η εγκοπή της πλάκας φάσης υπολογίζεται έτσι ώστε και οι δύο δέσμες ακτίνων που σχηματίζουν τις εικόνες άμεσης και περίθλασης να διαφέρουν κατά μήκος της οπτικής διαδρομής κατά το ένα τέταρτο του μήκους κύματος. Με αυτόν τον τρόπο, οι διαφορές φάσης που προηγουμένως ήταν αόρατες στο μάτι μετατρέπονται σε διαφορές έντασης και γίνονται ορατές.

Μικροσκόπιο φθορισμού είναι μια καλή μέθοδος για ενδοβιολογική κυτταρική παρατήρηση. Ένα μικροσκόπιο φθορισμού σάς επιτρέπει να παρατηρήσετε τον φθορισμό (λάμψη) ενός αριθμού ουσιών και δομών κυττάρων. Ο φθορισμός ενός αντικειμένου διεγείρεται από τις υπεριώδεις ή μπλε-ιώδεις ακτίνες από ειδικές πηγές φωτός. Η ακτινοβολία από ένα αντικείμενο έχει πάντα μεγαλύτερο μήκος κύματος από το συναρπαστικό φως. Το αντικείμενο παρατηρείται στις ακτίνες του φθορισμού του, οι οποίες διαχωρίζονται από τις ακτίνες του συναρπαστικού φωτός χρησιμοποιώντας φίλτρα φωτός. Ένας αριθμός ουσιών (μερικές βιταμίνες, χρωστικές, λιπίδια) έχουν τον δικό τους (πρωτογενή) φθορισμό. Οι κυτταρικές ουσίες που δεν έχουν αυτή την ιδιότητα προ-χρωματίζονται με ειδικές βαφές - φθοριόχρωμα, και στη συνέχεια παρατηρείται δευτερεύων φθορισμός.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία. Ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί ένα ρεύμα ηλεκτρονίων στο κενό αντί για φως για να δημιουργήσει μια εικόνα. Η δέσμη ηλεκτρονίων εστιάζεται όχι από φακούς, όπως σε ένα μικροσκόπιο φωτός, αλλά από ηλεκτρομαγνητικά πεδία. Η εικόνα παρατηρείται σε φθορίζουσα οθόνη και φωτογραφίζεται. Τα αντικείμενα κατά την ηλεκτρονική μικροσκοπία βρίσκονται σε βαθύ κενό, επομένως υποβάλλονται πρώτα σε στερέωση και ειδική επεξεργασία. Για το λόγο αυτό, μόνο τα νεκρά κύτταρα μπορούν να μελετηθούν χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Επιπλέον, πρέπει να είναι πολύ λεπτά, αφού η ροή των ηλεκτρονίων απορροφάται έντονα από το αντικείμενο. Από αυτή την άποψη, ως αντικείμενα χρησιμοποιούνται εξαιρετικά λεπτά τμήματα με πάχος 20-50 nm τοποθετημένα στις λεπτότερες μεμβράνες. ΣΕ μετάδοση (μετάδοση) ηλεκτρονικό μικροσκόπιοΤα ηλεκτρόνια περνούν μέσα από ένα αντικείμενο με τον ίδιο τρόπο που το φως περνά μέσα από αυτό σε ένα μικροσκόπιο φωτός. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης χρησιμοποιείται για τη μελέτη εξαιρετικά λεπτών τμημάτων μικροβίων, ιστών, καθώς και της δομής μικρών αντικειμένων (ιοί, μαστίγια κ.λπ.). ΣΕ ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσηςΜια επακριβώς εστιασμένη δέσμη ηλεκτρονίων κινείται μπρος-πίσω στην επιφάνεια του δείγματος. Σε αυτή την περίπτωση, τα ηλεκτρόνια που ανακλώνται από την επιφάνειά του συλλέγονται και σχηματίζουν μια εικόνα. Το πλεονέκτημα της χρήσης αυτού του τύπου ηλεκτρονικού μικροσκοπίου είναι ότι δημιουργεί μια τρισδιάστατη εικόνα. Ως εκ τούτου, η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης χρησιμοποιείται για τη μελέτη της επιφάνειας των αντικειμένων. Ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έχει ανάλυση περίπου 1-2 nm. Αυτό είναι αρκετό για τη μελέτη των μακρομορίων.

Αυτοραδιογραφία. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη χρήση ουσιών που επισημαίνονται με ραδιενεργά ισότοπα. Εάν ένα ραδιενεργό ισότοπο που απορροφάται από τα κύτταρα κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού προστεθεί στο μέσο, ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός του μπορεί στη συνέχεια να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας αυτοραδιογραφία. Με αυτή τη μέθοδο, λεπτές τομές κυττάρων τοποθετούνται σε φιλμ. Το φιλμ σκουραίνει κάτω από εκείνα τα μέρη όπου βρίσκονται τα ραδιενεργά ισότοπα. Ο φώσφορος χρησιμοποιείται ως ισότοπα ( P 32), σίδηρος (Fe 59), θείο (S 35 ), άνθρακας (C 14), τρίτιο ( H 3 ) κ.λπ.

Φυγοκέντρηση. Η μέθοδος ξεκίνησε το 1926, όταν ο Svedberg εφηύρε μια αναλυτική φυγόκεντρο και τη χρησιμοποίησε για να προσδιορίσει το μοριακό βάρος της αιμοσφαιρίνης. Πριν από τη φυγοκέντρηση, είναι απαραίτητο να καταστραφεί η κυτταρική μεμβράνη. Η καταστροφή πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας δόνηση υπερήχων, οσμωτικό σοκ, λείανση και συμπίεση μέσω μιας μικρής οπής. Με προσεκτική καταστροφή, ορισμένα κυτταρικά οργανίδια παραμένουν ανέπαφα. Οι τεμαχισμένοι ιστοί με κατεστραμμένες κυτταρικές μεμβράνες τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες και περιστρέφονται σε φυγόκεντρο με υψηλή ταχύτητα. Η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι διαφορετικά κυτταρικά οργανίδια έχουν διαφορετική μάζα και πυκνότητα. Πιο πυκνά οργανίδια εναποτίθενται σε δοκιμαστικό σωλήνα σε χαμηλές ταχύτητες φυγοκέντρησης, λιγότερο πυκνά - σε υψηλές ταχύτητες. Αυτά τα στρώματα μελετώνται χωριστά. Έτσι, οι πυρήνες και τα μη κατεστραμμένα κύτταρα εγκαθίστανται γρήγορα σε σχετικά χαμηλές ταχύτητες και σχηματίζουν ένα ίζημα στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης. Σε υψηλότερες ταχύτητες, τα μιτοχόνδρια κατακρημνίζονται και σε ακόμη υψηλότερες ταχύτητες και μεγαλύτερες περιόδους φυγοκέντρησης, τα ριβοσώματα κατακρημνίζονται. Τυπικά, τέτοια καθαρισμένα συστατικά διατηρούν υψηλή βιοχημική δράση.

Μέθοδος καλλιέργειας κυττάρων και ιστών συνίσταται στο γεγονός ότι από ένα ή περισσότερα κύτταρα σε ένα ειδικό θρεπτικό μέσο μπορεί να ληφθεί μια ομάδα κυττάρων του ίδιου τύπου. Αυτή η μέθοδος έχει τεράστιες προοπτικές όχι μόνο για την κυτταρολογία, αλλά και για την ιατρική και τη γεωργία. Έτσι, οι κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιούνται για την αποσαφήνιση των προτύπων διαφοροποίησης, της αλληλεπίδρασης των κυττάρων με το περιβάλλον, της προσαρμογής, της γήρανσης, του μετασχηματισμού κ.λπ. Στη βιοτεχνολογία, οι κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιούνται για την παραγωγή εμβολίων και βιολογικά δραστικών ουσιών. Στη φαρμακολογία, χρησιμοποιούνται ως αντικείμενα δοκιμής κατά τη δοκιμή νέων φαρμάκων. Ιδρυτής αυτής της μεθόδου είναι ο Αμερικανός ζωολόγος και εμβρυολόγος R. Garrison (1879-1959), ο οποίος το 1907 κατάφερε να καλλιεργήσει κύτταρα σαλαμάνδρας σε τεχνητό περιβάλλον έξω από το σώμα. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν πολλοί τύποι φυτικών και ζωικών κυττάρων in vitro , και αυτή η μέθοδος μας επέτρεψε να κάνουμε μια σειρά από σημαντικές ανακαλύψεις στον τομέα της κυτταρικής φυσιολογίας. Εκφραση in vitro (Λατινικά σημαίνει «σε γυαλί») σημαίνει ότι η έρευνα δεν πραγματοποιήθηκε σε ζωντανό οργανισμό, αλλά σε γυάλινο δοχείο του ενός ή του άλλου είδους. Σε αντίθεση με την πρώτη έκφραση in vivo υποδηλώνει ένα πείραμα με έναν ολόκληρο, ζωντανό οργανισμό. Οι καλλιέργειες που παρασκευάζονται απευθείας από τους ιστούς του σώματος ονομάζονται πρωτογενείς καλλιέργειες.Στις περισσότερες περιπτώσεις, κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας μπορούν να μεταφερθούν από ένα δίσκο καλλιέργειας και να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων δευτερογενείς καλλιέργειες.Οι κυτταρικές σειρές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία κλώνων που προέρχονται από ένα μόνο προγονικό κύτταρο. Μπορεί να γίνει κυτταρική σύντηξηενός ή διαφορετικών τύπων. Για να επιτευχθεί σύντηξη, τα κύτταρα εκτίθενται σε ιικά ένζυμα ή πολυαιθυλενογλυκόλη. Αυτές οι ουσίες βλάπτουν την πλασματική μεμβράνη των κυττάρων, με αποτέλεσμα ένα κύτταρο με δύο ξεχωριστούς πυρήνες. Μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημα, ένα τέτοιο κύτταρο διαιρείται με μίτωση, σχηματίζοντας ένα υβριδικό κύτταρο. Σε ένα υβριδικό κύτταρο, όλα τα χρωμοσώματα συνδυάζονται σε έναν μεγάλο πυρήνα. Τέτοια υβριδικά κύτταρα μπορούν να κλωνοποιηθούν για να παραχθεί μια υβριδική κυτταρική σειρά. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, κατέστη δυνατό να ληφθούν υβριδικά κύτταρα ανθρώπου και ποντικού, ανθρώπου και φρύνου. Τα προκύπτοντα υβριδικά κύτταρα είναι ασταθή και, μετά από πολυάριθμες κυτταρικές διαιρέσεις, χάνουν τα περισσότερα από τα χρωμοσώματα είτε του ενός είτε του άλλου τύπου. Το τελικό προϊόν γίνεται, για παράδειγμα, ουσιαστικά ένα κύτταρο ποντικού με καθόλου ή μόνο ένα ίχνος ποσότητας ανθρώπινων γονιδίων. Επομένως, αυτή η τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη χαρτογράφηση γονιδίων σε ανθρώπινα χρωμοσώματα.

Μικροχειρουργική.Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη χρήση μικροχειριστών. Είναι συσκευές που παρέχουν ακριβείς κινήσεις μικροοργάνων στο κλουβί. Τα μικρο όργανα είναι συνήθως κατασκευασμένα από γυαλί. Η μορφή τους καθορίζεται από τα καθήκοντα των μικροχειρουργικών επεμβάσεων. Μπορούν να έχουν τη μορφή βελόνων, συρίγγων, πιπέτων, σπάτουλας, νυστέρι κ.λπ. Χρησιμοποιώντας μικροχειρισμούς, μπορούν να γίνουν διάφορες επεμβάσεις στα κύτταρα (έγχυση ουσιών στα κύτταρα, εξαγωγή και μεταμόσχευση πυρήνων, τοπική βλάβη στις κυτταρικές δομές κ.λπ.). Οι μικροχειρουργικές επεμβάσεις λειτουργούν ιδιαίτερα καλά σε μεγάλα κύτταρα (μονοκύτταρα κύτταρα, ωάρια αμφιβίων, εμβρυϊκά κύτταρα ορισμένων ζώων). Έτσι, το κύτταρο της αμοιβάδας μπορεί να χωριστεί σε τρία κύρια συστατικά - μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και πυρήνα. Αυτά τα συστατικά μπορούν στη συνέχεια να επανασυναρμολογηθούν για να σχηματίσουν ένα ζωντανό κύτταρο. Με αυτόν τον τρόπο μπορούν να ληφθούν τεχνητά κύτταρα που αποτελούνται από συστατικά διαφορετικών τύπων αμοιβάδων. Οι μικροχειρουργικές επεμβάσεις εκτελούνται όχι μόνο με μικροεργαλεία, αλλά με εστιασμένη δέσμη υπεριωδών ακτίνων (μικροέγχυση δέσμης).

Εκτός από τις παραπάνω μεθόδους, για τη μελέτη των κυττάρων χρησιμοποιούνται χρωματογραφία, ηλεκτροφόρηση και κάποιες άλλες. Νέες μέθοδοι έχουν κάνει τεράστια βήματα στη μελέτη των κυττάρων. Ωστόσο, πρέπει να θυμόμαστε ότι οι κλασικές μέθοδοι κυτταρολογίας, που βασίζονται στη στερέωση, τη χρώση και τη μελέτη των κυττάρων κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός, εξακολουθούν να διατηρούν πρακτική σημασία.

Διάλεξη 1.

Δομή φυτικών κυττάρων

Μικροσκόπιο φωτός

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Διαφορική φυγοκέντρηση

Μέθοδος κυτταροκαλλιέργειας

Το κύτταρο είναι η βασική δομική και λειτουργική μονάδα των ζωντανών οργανισμών.

Κύτταρα εμβρυϊκόΟι (μη εξειδικευμένοι) ιστοί ζώων και φυτών σε γενικές γραμμές δομής είναι πολύ παρόμοιοι. Ήταν αυτή η συγκυρία που κάποτε ήταν η αιτία για την εμφάνιση και την ανάπτυξη της κυτταρικής θεωρίας. Μορφολογικές διαφορές εμφανίζονται ήδη σε διαφοροποιημένα κύτταρα εξειδικευμένων ιστών φυτών και ζώων. Τα δομικά χαρακτηριστικά ενός φυτικού κυττάρου, όπως και τα φυτά στο σύνολό τους, συνδέονται με τον τρόπο ζωής και τη διατροφή. Τα περισσότερα φυτά οδηγούν έναν σχετικά ακίνητο (προσκολλημένο) τρόπο ζωής. Η ιδιαιτερότητα της διατροφής των φυτών είναι ότι το νερό και τα θρεπτικά συστατικά: οργανικά και ανόργανα, διασκορπίζονται γύρω και το φυτό πρέπει να τα απορροφήσει με διάχυση. Επιπλέον, τα πράσινα φυτά στο φως πραγματοποιούν μια αυτότροφη μέθοδο διατροφής. Χάρη σε αυτό, έχουν εξελιχθεί ορισμένα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της δομής και της ανάπτυξης των φυτικών κυττάρων. Αυτά περιλαμβάνουν:

	διαρκής κυτταρικό τοίχωμα πολυσακχαρίτη, που περιβάλλει το κελί και σχηματίζει ένα άκαμπτο πλαίσιο.
	πλαστιδικό σύστημα , που προέκυψε σε σχέση με τον αυτότροφο τύπο διατροφής.
	κενοτόπιο σύστημα , το οποίο στα ώριμα κύτταρα αντιπροσωπεύεται συνήθως από ένα μεγάλο κεντρικό κενοτόπιο, που καταλαμβάνει έως και το 95% του κυτταρικού όγκου και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση πίεση στροβιλισμού;
	ένας ειδικός τύπος κυτταρικής ανάπτυξης από διαστρέμματα(λόγω αύξησης του όγκου του κενοτοπίου).
	παντοδυναμία , δηλαδή η δυνατότητα αναγέννησης πλήρους φυτού από διαφοροποιημένο φυτικό κύτταρο.
	Υπάρχει μια ακόμη λεπτομέρεια που διακρίνει τα φυτικά κύτταρα από τα ζωικά κύτταρα: στα φυτά, κατά τη διαίρεση των κυττάρων, δεν εκφράζονται κεντρόλες.

Η δομή ενός κυττάρου στην πιο γενική του μορφή είναι γνωστή σε εσάς από το γενικό μάθημα της βιολογίας σας και κατά την προετοιμασία για τις εισαγωγικές εξετάσεις μελετήσατε αρκετά καλά αυτό το θέμα. Αυτό το θέμα συζητείται επίσης σε διάφορες πτυχές σε σχετικά πανεπιστημιακά μαθήματα (για παράδειγμα, ζωολογία ασπόνδυλων, κατώτερα φυτά). Επιπλέον, μια πιο λεπτομερής γνωριμία με το κύτταρο σε υψηλό επίπεδο θα είναι στο μάθημα της «κυτταρολογίας». Είναι σημαντικό για εμάς να εστιάσουμε στα συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά ενός φυτικού κυττάρου, κυρίως στα κύτταρα ενός ανώτερου φυτού.

Μια πολύ επιφανειακή εξέταση της δομής ενός τυπικού φυτικού κυττάρου αποκαλύπτει τρία κύρια συστατικά: (1) κυτταρικό τοίχωμα, (2) ένα κενοτόπιο, το οποίο καταλαμβάνει κεντρική θέση στα ώριμα κύτταρα και γεμίζει σχεδόν ολόκληρο τον όγκο τους και (3) πρωτοπλάστης, που ωθείται από το κενοτόπιο προς την περιφέρεια με τη μορφή στρώματος τοιχώματος. Αυτά τα συστατικά είναι που ανιχνεύονται σε χαμηλή μεγέθυνση ενός μικροσκοπίου φωτός. Επιπλέον, η κυτταρική μεμβράνη και το κενοτόπιο είναι προϊόντα της ζωτικής δραστηριότητας του πρωτοπλάστη.

Ζωντανό κυτταρικό σώμα; Ο πρωτοπλάστης αποτελείται από οργανίδια βυθισμένα υαλόπλασμα. Οι κυτταρικοί οργανισμοί περιλαμβάνουν: πυρήνα, πλαστίδια, μιτοχόνδρια, δικτυοσώματα, ενδοπλασματικό δίκτυο, μικροσώματα κ.λπ. Το υαλόπλασμα με οργανίδια μείον τον πυρήνα είναι κυτόπλασμακύτταρα.

Για να εκφραστεί το μέγεθος των υποκυτταρικών δομών, χρησιμοποιούνται ορισμένα μέτρα μήκους: μικρόμετροΚαι νανόμετρο.

Το μικρόμετρο στο σύστημα μονάδων μέτρησης SI είναι μια τιμή ίση με 10 -6 m . Με άλλα λόγια, ένα μικρόμετρο (συντομογραφία μm) είναι 1/1000000 του μέτρου και 1/1000 του χιλιοστού. 1 μm = 10-6 μ . Παλιά ονομασία αυτού του μέτρου μικρόν.

Ένα νανόμετρο στο ίδιο σύστημα αντιπροσωπεύει ένα εκατομμυριοστό του χιλιοστού 1 nm = 10 -9 m και ένα χιλιοστό του μικρομέτρου.

Το μέγεθος και το σχήμα των φυτικών κυττάρων ποικίλλει ευρέως. Τυπικά, τα μεγέθη των κυττάρων των ανώτερων φυτών κυμαίνονται από 10 έως 300 μικρά. Είναι αλήθεια ότι υπάρχουν γιγάντια κύτταρα, για παράδειγμα, τα κύτταρα του ζουμερού πολτού των εσπεριδοειδών έχουν διάμετρο πολλών χιλιοστών ή οι εξαιρετικά μακριές ίνες των τσουκνίδων φτάνουν τα 80 mm σε μήκος με μικροσκοπικό πάχος.

Διακρίνονται από το σχήμα ισοδιαμετρικήκελιά των οποίων οι γραμμικές διαστάσεις προς όλες τις κατευθύνσεις είναι ίσες ή διαφέρουν ελαφρώς (δηλαδή, το μήκος, το πλάτος και το ύψος αυτών των κελιών είναι συγκρίσιμα). Τέτοια κύτταρα ονομάζονται παρεγχυματικά (παρέγχυμα).

Τα έντονα επιμήκη κύτταρα, στα οποία το μήκος είναι πολλές φορές (μερικές φορές εκατοντάδες και χιλιάδες) μεγαλύτερο από το ύψος και το πλάτος, ονομάζονται προσεγγυματικά (προσένχημα).

Μέθοδοι μελέτης φυτικών κυττάρων

Πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των κυττάρων, οι δυνατότητες των οποίων καθορίζουν το επίπεδο των γνώσεών μας σε αυτόν τον τομέα. Η πρόοδος στη μελέτη της κυτταρικής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένων των πιο εξαιρετικών επιτευγμάτων των τελευταίων ετών, συνδέεται συνήθως με τη χρήση νέων μεθόδων. Επομένως, για μια πληρέστερη κατανόηση της κυτταρικής βιολογίας, είναι απαραίτητο να έχουμε τουλάχιστον κάποια κατανόηση των κατάλληλων μεθόδων για τη μελέτη των κυττάρων.

Μικροσκόπιο φωτός

Η παλαιότερη και, ταυτόχρονα, η πιο κοινή μέθοδος μελέτης κυττάρων είναι η μικροσκοπία. Μπορούμε να πούμε ότι η αρχή της μελέτης των κυττάρων τέθηκε με την εφεύρεση του οπτικού μικροσκοπίου φωτός.

Το γυμνό ανθρώπινο μάτι έχει ανάλυση περίπου 1/10 mm. Αυτό σημαίνει ότι αν κοιτάξετε δύο γραμμές που απέχουν λιγότερο από 0,1 mm, συγχωνεύονται σε μία. Για τη διάκριση των δομών που βρίσκονται πιο κοντά, χρησιμοποιούνται οπτικά όργανα, όπως ένα μικροσκόπιο.

Αλλά οι δυνατότητες ενός μικροσκοπίου φωτός δεν είναι απεριόριστες. Το όριο ανάλυσης ενός μικροσκοπίου φωτός καθορίζεται από το μήκος κύματος του φωτός, δηλαδή, ένα οπτικό μικροσκόπιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για τη μελέτη δομών των οποίων οι ελάχιστες διαστάσεις είναι συγκρίσιμες με το μήκος κύματος της ακτινοβολίας φωτός. Το καλύτερο μικροσκόπιο φωτός έχει ικανότητα ανάλυσης περίπου 0,2 microns (ή 200 nm), που είναι περίπου 500 φορές καλύτερη από το ανθρώπινο μάτι. Είναι θεωρητικά αδύνατο να κατασκευαστεί ένα μικροσκόπιο φωτός με υψηλή ανάλυση.

Πολλά συστατικά του κυττάρου είναι παρόμοια στην οπτική τους πυκνότητα και, χωρίς ειδική επεξεργασία, είναι πρακτικά αόρατα σε ένα συμβατικό μικροσκόπιο φωτός. Για να γίνουν ορατά, διάφορα βαφέςμε μια ορισμένη επιλεκτικότητα.

Στις αρχές του 19ου αι. Υπήρχε ανάγκη για βαφές για τη βαφή υφασμάτων, που με τη σειρά τους προκάλεσε την επιταχυνόμενη ανάπτυξη της οργανικής χημείας. Αποδείχθηκε ότι μερικές από αυτές τις χρωστικές βάφουν επίσης βιολογικούς ιστούς και, εντελώς απροσδόκητα, συχνά δεσμεύονται κατά προτίμηση σε ορισμένα συστατικά του κυττάρου. Η χρήση τέτοιων επιλεκτικών βαφών καθιστά δυνατή την ακριβέστερη μελέτη της εσωτερικής δομής του κυττάρου. Ακολουθούν μερικά μόνο παραδείγματα:

	βαφή αιματοξυλίνηχρωματίζει ορισμένα συστατικά του πυρήνα μπλε ή ιώδες.
	μετά από διαδοχική επεξεργασία phloroglucinolκαι μετά με υδροχλωρικό οξύ οι λιγνιτωμένες κυτταρικές μεμβράνες γίνονται κόκκινες.
	βαφή Σουδάν IIIχρωματίζει ροζ τις κυτταρικές μεμβράνες που έχουν υποστεί υπόγειο χρώμα.
	Ένα ασθενές διάλυμα ιωδίου σε ιωδιούχο κάλιο μετατρέπει τους κόκκους του αμύλου σε μπλε.

Για μικροσκοπική εξέταση των περισσότερων ιστών πριν από τη χρώση διορθώσετε. Μόλις σταθεροποιηθούν, τα κύτταρα γίνονται διαπερατά στις βαφές και η κυτταρική δομή σταθεροποιείται. Ένα από τα πιο κοινά σταθεροποιητικά στη βοτανική είναι η αιθυλική αλκοόλη.

Η στερέωση και η χρώση δεν είναι οι μόνες διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή παρασκευασμάτων. Οι περισσότεροι ιστοί είναι πολύ παχύς για να παρατηρηθούν αμέσως σε υψηλή ανάλυση. Επομένως, εκτελούνται λεπτές τομές μικροτόμος. Αυτή η συσκευή χρησιμοποιεί την αρχή του τεμαχιστή ψωμιού. Οι φυτικοί ιστοί κόβονται σε ελαφρώς παχύτερα τμήματα από τους ζωικούς ιστούς, επειδή τα φυτικά κύτταρα είναι συνήθως μεγαλύτερα. Το πάχος των τμημάτων φυτικού ιστού για μικροσκοπία φωτός είναι περίπου 10 μικρά - 20 μικρά. Μερικοί ιστοί είναι πολύ μαλακοί για να κοπούν αμέσως. Ως εκ τούτου, μετά τη στερέωση, χύνονται σε λιωμένη παραφίνη ή ειδική ρητίνη, η οποία διαποτίζει ολόκληρο το ύφασμα. Μετά την ψύξη, σχηματίζεται ένα συμπαγές μπλοκ, το οποίο στη συνέχεια κόβεται χρησιμοποιώντας μικροτόμο. Είναι αλήθεια ότι το γέμισμα χρησιμοποιείται πολύ λιγότερο συχνά για φυτικούς ιστούς παρά για ζώα. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι τα φυτικά κύτταρα έχουν ισχυρά κυτταρικά τοιχώματα που αποτελούν το πλαίσιο του ιστού. Τα λιγνωμένα κοχύλια είναι ιδιαίτερα ισχυρά.

Ωστόσο, η έκχυση μπορεί να διαταράξει τη δομή του κυττάρου, επομένως χρησιμοποιείται άλλη μέθοδος όπου αυτός ο κίνδυνος μειώνεται; γρήγορη κατάψυξη. Εδώ μπορείτε να κάνετε χωρίς στερέωση και πλήρωση. Ο κατεψυγμένος ιστός κόβεται χρησιμοποιώντας ειδικό μικροτόμο (κρυότομο).

Τα κατεψυγμένα τμήματα που παρασκευάζονται με αυτόν τον τρόπο έχουν το ευδιάκριτο πλεονέκτημα της καλύτερης διατήρησης των φυσικών δομικών χαρακτηριστικών. Ωστόσο, μαγειρεύονται πιο δύσκολα και η παρουσία κρυστάλλων πάγου εξακολουθεί να καταστρέφει μερικές από τις λεπτομέρειες.

Οι μικροσκόποι ανέκαθεν ανησυχούσαν για την πιθανότητα απώλειας και παραμόρφωσης ορισμένων κυτταρικών συστατικών κατά τη διαδικασία στερέωσης και χρώσης. Επομένως, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται επαληθεύονται με άλλες μεθόδους.

Η ευκαιρία να εξεταστούν τα ζωντανά κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο, αλλά με τέτοιο τρόπο ώστε οι λεπτομέρειες της δομής τους να φαίνονται πιο καθαρά, φαινόταν πολύ δελεαστική. Αυτή η ευκαιρία παρέχεται από ειδικά οπτικά συστήματα: αντίθεση φάσηςΚαι παρέμβασημικροσκόπια. Είναι γνωστό ότι τα κύματα φωτός, όπως και τα κύματα του νερού, μπορούν να παρεμβαίνουν μεταξύ τους, αυξάνοντας ή μειώνοντας το πλάτος των κυμάτων που προκύπτουν. Σε ένα συμβατικό μικροσκόπιο, καθώς τα κύματα φωτός διέρχονται από μεμονωμένα συστατικά ενός κυττάρου, αλλάζουν τη φάση τους, αν και το ανθρώπινο μάτι δεν μπορεί να ανιχνεύσει αυτές τις διαφορές. Αλλά λόγω παρεμβολής, τα κύματα μπορούν να μετατραπούν και στη συνέχεια τα διαφορετικά συστατικά του κυττάρου μπορούν να διακριθούν μεταξύ τους κάτω από ένα μικροσκόπιο, χωρίς να καταφύγουμε σε χρώση. Αυτά τα μικροσκόπια χρησιμοποιούν 2 δέσμες κυμάτων φωτός που αλληλεπιδρούν (υπερθέτουν) το ένα πάνω στο άλλο, αυξάνοντας ή μειώνοντας το πλάτος των κυμάτων που εισέρχονται στο μάτι από διαφορετικά συστατικά στοιχεία του κυττάρου.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Οι δυνατότητες ενός μικροσκοπίου φωτός, όπως ήδη αναφέρθηκε, περιορίζονται από το μήκος κύματος του ορατού φωτός. Η μέγιστη ανάλυσή του είναι περίπου 0,2 μικρά.

Μια σημαντική πρόοδος έγινε στη μικροσκοπία τη δεκαετία του 1920, όταν ανακαλύφθηκε ότι κατάλληλα επιλεγμένα ηλεκτρομαγνητικά πεδία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν φακοί για την εστίαση δέσμης ηλεκτρονίων.

Το μήκος κύματος ενός ηλεκτρονίου είναι πολύ μικρότερο από το μήκος κύματος του ορατού φωτός και εάν χρησιμοποιούνται ηλεκτρόνια αντί του φωτός, το όριο ανάλυσης του μικροσκοπίου μπορεί να μειωθεί αισθητά.

Με βάση όλα αυτά, δημιουργήθηκε ένα μικροσκόπιο στο οποίο αντί για φως χρησιμοποιείται μια δέσμη ηλεκτρονίων. Το πρώτο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κατασκευάστηκε το 1931 από τους Knoll και Ruska στη Γερμανία. Ωστόσο, πέρασαν πολλά χρόνια προτού καταστεί δυνατή η μελέτη τομών ιστού χρησιμοποιώντας αυτό το μικροσκόπιο. Μόνο στη δεκαετία του '50 αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την παραγωγή τμημάτων με τις απαραίτητες ιδιότητες. Από τότε, ξεκίνησε μια νέα εποχή μικροσκοπίας και μια ροή πληροφοριών σχετικά με τη λεπτή δομή των κυττάρων κυριολεκτικά ξεχύθηκε στην επιστήμη. (υπερδομή κυττάρων).

Οι δυσκολίες της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας είναι ότι απαιτείται ειδική επεξεργασία παρασκευασμάτων για τη μελέτη βιολογικών δειγμάτων.

Η πρώτη δυσκολία είναι ότι τα ηλεκτρόνια έχουν πολύ περιορισμένη διεισδυτική ισχύ, επομένως πρέπει να προετοιμαστούν εξαιρετικά λεπτά τμήματα, πάχους 50 - 100 nm. Για να ληφθούν τέτοιες λεπτές τομές, ο ιστός εμποτίζεται πρώτα με ρητίνη: η ρητίνη πολυμερίζεται για να σχηματίσει ένα σκληρό πλαστικό μπλοκ. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα κοφτερό γυάλινο ή διαμαντένιο μαχαίρι, τα τμήματα κόβονται σε ειδικό μικροτόμο.

Υπάρχει μια άλλη δυσκολία: όταν τα ηλεκτρόνια περνούν μέσα από βιολογικό ιστό, δεν λαμβάνεται εικόνα αντίθεσης. Προκειμένου να ληφθεί αντίθεση, λεπτές τομές βιολογικών δειγμάτων εμποτίζονται με άλατα βαρέων μετάλλων.

Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. ΣΕ μετάδοση(μετάδοση) μικροσκόπιο, μια δέσμη ηλεκτρονίων, περνώντας μέσα από ένα ειδικά προετοιμασμένο δείγμα, αφήνει την εικόνα της στην οθόνη. Η ανάλυση ενός σύγχρονου ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης είναι σχεδόν 400 φορές μεγαλύτερη από αυτή του φωτός. Αυτά τα μικροσκόπια έχουν ανάλυση περίπου 0,5 nm (για σύγκριση, η διάμετρος ενός ατόμου υδρογόνου είναι περίπου 0,1 nm).

Παρά την τόσο υψηλή ανάλυση, τα ηλεκτρονικά μικροσκόπια μετάδοσης έχουν σημαντικά μειονεκτήματα:

Μια τρισδιάστατη (ογκομετρική) εικόνα λαμβάνεται χρησιμοποιώντας έρευναηλεκτρονικό μικροσκόπιο (EM). Εδώ η δέσμη δεν διέρχεται από το δείγμα, αλλά ανακλάται από την επιφάνειά του.

Το δείγμα δοκιμής στερεώνεται και στεγνώνει και στη συνέχεια καλύπτεται με ένα λεπτό στρώμα μετάλλου; η επέμβαση ονομάζεται σκίαση(το δείγμα είναι σκιασμένο).

Στη σάρωση ΗΜ, μια εστιασμένη δέσμη ηλεκτρονίων κατευθύνεται σε ένα δείγμα (το δείγμα σαρώνεται). Ως αποτέλεσμα, η μεταλλική επιφάνεια του δείγματος εκπέμπει δευτερεύοντα ηλεκτρόνια χαμηλής ενέργειας. Καταγράφονται και μετατρέπονται σε εικόνα σε οθόνη τηλεόρασης. Η μέγιστη ανάλυση ενός μικροσκοπίου σάρωσης είναι μικρή, περίπου 10 nm, αλλά η εικόνα είναι τρισδιάστατη.

Μέθοδος Freeze-chip

Θεμελιωδώς νέες δυνατότητες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας άνοιξαν σχετικά πρόσφατα, μετά την ανάπτυξη της μεθόδου «πάγωμα – θρυμματισμός».Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, εξετάζονται οι καλύτερες λεπτομέρειες της δομής του κυττάρου και λαμβάνεται μια τρισδιάστατη εικόνα σε ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης.

Κατά τη διάρκεια της κανονικής κατάψυξης, σχηματίζονται κρύσταλλοι πάγου στα κύτταρα, οι οποίοι παραμορφώνουν αισθητά τη δομή τους. Για να αποφευχθεί αυτό, τα κύτταρα καταψύχονται πολύ γρήγορα σε θερμοκρασία υγρού αζώτου (- 196 C). Με τέτοια στιγμιαία κατάψυξη, οι κρύσταλλοι πάγου δεν έχουν χρόνο να σχηματιστούν και το κύτταρο δεν υφίσταται παραμόρφωση.

Το παγωμένο μπλοκ χωρίζεται με μια λεπίδα μαχαιριού (εξ ου και το όνομα της μεθόδου). Στη συνέχεια, συνήθως σε θάλαμο κενού, η περίσσεια πάγου αφαιρείται με εξάχνωση. Αυτή η λειτουργία ονομάζεται χαλκογραφία.Μετά τη χάραξη, το ανάγλυφο στο επίπεδο διάσπασης ορίζεται πιο ξεκάθαρα. Λήψη δείγματος σκιασμένος,δηλαδή ένα λεπτό στρώμα βαρέων μετάλλων ψεκάζεται στην επιφάνεια του δείγματος. Ωστόσο, το κόλπο είναι ότι η εναπόθεση εκτελείται υπό γωνία ως προς την επιφάνεια του δείγματος. Αυτό είναι ένα πολύ σημαντικό σημείο. Εμφανίζεται ένα εφέ σκιάς και η εικόνα φαίνεται τρισδιάστατη.

Σε ένα μικροσκόπιο μετάδοσης, η δέσμη ηλεκτρονίων μπορεί να διαπεράσει μόνο πολύ λεπτά τμήματα. Το συνηθισμένο πάχος των σκιασμένων δειγμάτων είναι υπερβολικό, επομένως η οργανική ύλη που βρίσκεται κάτω από το μεταλλικό στρώμα πρέπει να διαλυθεί. Το αποτέλεσμα είναι ένα λεπτό μέταλλο πανομοιότυπο(ή αποτύπωμα) από την επιφάνεια του δείγματος. Ένα αντίγραφο χρησιμοποιείται σε ένα μικροσκόπιο μετάδοσης.

Αυτή η μέθοδος παρείχε, για παράδειγμα, μια μοναδική ευκαιρία να παρατηρηθεί η εσωτερική δομή των κυτταρικών μεμβρανών.

Διαφορική φυγοκέντρηση

Εκτός από τη μικροσκοπία, η άλλη κύρια και διαδεδομένη μέθοδος για τη μελέτη των κυττάρων είναι διαφορική φυγοκέντρησηή κλασματοποίηση.

Η αρχή της μεθόδου είναι ότι κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης αναπτύσσεται μια φυγόκεντρος δύναμη, υπό την επίδραση της οποίας τα αιωρούμενα σωματίδια καθιζάνουν στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης.

Με την εισαγωγή της υπερφυγοκέντρησης στις αρχές της δεκαετίας του 1940, ο διαχωρισμός των κυτταρικών συστατικών έγινε εφικτός.

Πριν υποβάλετε τα κύτταρα σε φυγοκέντρηση, πρέπει να καταστραφούν - το άκαμπτο πλαίσιο των κυτταρικών μεμβρανών πρέπει να καταστραφεί. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι: δόνηση υπερήχων, συμπίεση μέσω μικρών οπών ή η πιο συνηθισμένη λείανση φυτικών ιστών με γουδοχέρι σε κονίαμα πορσελάνης. Με προσεκτική χρήση μεθόδων καταστροφής, ορισμένα οργανίδια μπορούν να διατηρηθούν ανέπαφα.

Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης υψηλής ταχύτητας, τα μεγάλα κυτταρικά συστατικά (όπως οι πυρήνες) καθιζάνουν γρήγορα (ιζήματα) σε σχετικά χαμηλές ταχύτητες και σχηματίζουν ένα ίζημα στο κάτω μέρος του σωλήνα φυγοκέντρησης. Σε υψηλότερους ρυθμούς, μικρότερα συστατικά όπως οι χλωροπλάστες και τα μιτοχόνδρια καθιζάνουν.

Δηλαδή, κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, τα στοιχεία του κυττάρου διασπώνται σε κλάσματα: μεγάλα και μικρά, γι' αυτό και το δεύτερο όνομα της μεθόδου; κλασματοποίηση. Επιπλέον, όσο υψηλότερη είναι η ταχύτητα και η διάρκεια της φυγοκέντρησης, τόσο λεπτότερο είναι το κλάσμα που προκύπτει.

Ο ρυθμός καθίζησης (απόθεσης) των συστατικών εκφράζεται χρησιμοποιώντας συντελεστής καθίζησης,ορίζεται ΜΙΚΡΟ.

Στάδια διαφορικής φυγοκέντρησης: χαμηλή ταχύτητα (πυρήνες, κυτταροσκελετός), μέση ταχύτητα (χλωροπλάστες), υψηλή ταχύτητα (μιτοχόνδρια, ριζοσώματα, μικροσώματα), πολύ υψηλή ταχύτητα (ριβοσώματα).

Τα εκχυλίσματα κλασματοποιημένων κυττάρων, που ονομάζονται επίσης συστήματα χωρίς κύτταρα, χρησιμοποιούνται ευρέως για τη μελέτη ενδοκυτταρικών διεργασιών. Μόνο με την εργασία με εκχυλίσματα χωρίς κύτταρα μπορεί να εδραιωθεί ο λεπτομερής μοριακός μηχανισμός των βιολογικών διεργασιών. Έτσι, η χρήση της συγκεκριμένης μεθόδου έφερε θριαμβευτική επιτυχία στη μελέτη της βιοσύνθεσης πρωτεϊνών.

Λοιπόν, γενικά, καθαρά κλάσματα ενδοκυτταρικών δομών μπορούν να υποβληθούν σε οποιονδήποτε τύπο ανάλυσης.

Μέθοδος κυτταροκαλλιέργειας

Τα ζωικά κύτταρα που απομονώνονται σε καλλιέργεια (δηλαδή τοποθετούνται σε ένα θρεπτικό μέσο) πεθαίνουν μετά από έναν ορισμένο αριθμό διαιρέσεων και επομένως θεωρούνται ένα δύσκολο και άβολο αντικείμενο για καλλιέργεια. Ένα άλλο πράγμα είναι τα φυτικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να διαιρεθούν απεριόριστες φορές.

Η μέθοδος κυτταροκαλλιέργειας διευκολύνει τη μελέτη των μηχανισμών διαφοροποίησης των κυττάρων στα φυτά.

Σε ένα θρεπτικό μέσο, τα φυτικά κύτταρα σχηματίζουν μια ομοιογενή αδιαφοροποίητη κυτταρική μάζα; κάλος.Ο κάλος αντιμετωπίζεται με ορμόνες. Υπό την επίδραση των ορμονών, τα κύτταρα του τύλου μπορούν να δημιουργήσουν διάφορα όργανα.

Η δομή και η λειτουργία ενός φυτικού κυττάρου.

1. Δομή φυτικού κυττάρου: μεμβράνη κυτταρίνης, πλασματική μεμβράνη, κυτταρόπλασμα με οργανίδια, πυρήνας, κενοτόπια με κυτταρικό χυμό. Η παρουσία πλαστιδίων είναι το κύριο χαρακτηριστικό ενός φυτικού κυττάρου.

2. Λειτουργίες της κυτταρικής μεμβράνης - δίνει στο κύτταρο το σχήμα του, το προστατεύει από περιβαλλοντικούς παράγοντες.

3. Η πλασματική μεμβράνη είναι μια λεπτή μεμβράνη, αποτελείται από αλληλεπιδρώντα μόρια λιπιδίων και πρωτεϊνών, οριοθετεί το εσωτερικό περιεχόμενο από το εξωτερικό περιβάλλον, εξασφαλίζει τη μεταφορά νερού, μετάλλων και οργανικών ουσιών στο κύτταρο με όσμωση και ενεργή μεταφορά και επίσης αφαιρεί επιβλαβή απόβλητα.

4. Το κυτταρόπλασμα είναι το εσωτερικό ημι-υγρό περιβάλλον του κυττάρου στο οποίο βρίσκονται ο πυρήνας και τα οργανίδια, παρέχει συνδέσεις μεταξύ τους και συμμετέχει σε βασικές διαδικασίες της ζωής.

5. Ενδοπλασματικό δίκτυο - ένα δίκτυο διακλαδιζόμενων καναλιών στο κυτταρόπλασμα. Συμμετέχει στη σύνθεση πρωτεϊνών, λιπιδίων και υδατανθράκων και στη μεταφορά ουσιών. Τα ριβοσώματα είναι σώματα που βρίσκονται στο ER ή στο κυτταρόπλασμα, που αποτελούνται από RNA και πρωτεΐνη και εμπλέκονται στη σύνθεση πρωτεϊνών. Το EPS και τα ριβοσώματα είναι μια ενιαία συσκευή για τη σύνθεση και τη μεταφορά πρωτεϊνών.

6. Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια που οριοθετούνται από το κυτταρόπλασμα με δύο μεμβράνες. Σε αυτά με τη συμμετοχή ενζύμων οξειδώνονται οργανικές ουσίες και συντίθενται μόρια ΑΤΡ. Αύξηση της επιφάνειας της εσωτερικής μεμβράνης στην οποία βρίσκονται τα ένζυμα λόγω κρυστάλλων. Το ATP είναι μια οργανική ουσία πλούσια σε ενέργεια.

7. Πλασίδια (χλωροπλάστες, λευκοπλάστες, χρωμοπλάστες), η περιεκτικότητά τους στο κύτταρο είναι το κύριο χαρακτηριστικό του φυτικού οργανισμού. Οι χλωροπλάστες είναι πλαστίδια που περιέχουν την πράσινη χρωστική ουσία χλωροφύλλη, η οποία απορροφά την φωτεινή ενέργεια και τη χρησιμοποιεί για να συνθέσει οργανικές ουσίες από το διοξείδιο του άνθρακα και το νερό. Οι χλωροπλάστες διαχωρίζονται από το κυτταρόπλασμα με δύο μεμβράνες, πολυάριθμες αποφύσεις - grana στην εσωτερική μεμβράνη, στην οποία βρίσκονται μόρια και ένζυμα χλωροφύλλης.

8. Το σύμπλεγμα Golgi είναι ένα σύστημα κοιλοτήτων που οριοθετούνται από το κυτταρόπλασμα με μια μεμβράνη. Η συσσώρευση πρωτεϊνών, λιπών και υδατανθράκων σε αυτά. Πραγματοποίηση σύνθεσης λιπών και υδατανθράκων στις μεμβράνες.

9. Τα λυσοσώματα είναι σώματα που οριοθετούνται από το κυτταρόπλασμα με μία μόνο μεμβράνη. Τα ένζυμα που περιέχουν επιταχύνουν τη διάσπαση πολύπλοκων μορίων σε απλά: πρωτεΐνες σε αμινοξέα, σύνθετους υδατάνθρακες σε απλά, λιπίδια σε γλυκερίνη και λιπαρά οξέα και επίσης καταστρέφουν νεκρά μέρη του κυττάρου και ολόκληρα κύτταρα.

10. Κενοτόπια - κοιλότητες στο κυτταρόπλασμα γεμάτες με κυτταρικό χυμό, τόπος συσσώρευσης αποθεματικών θρεπτικών ουσιών και επιβλαβών ουσιών. ρυθμίζουν την περιεκτικότητα σε νερό στο κύτταρο.

11. Κυτταρικά εγκλείσματα - σταγόνες και κόκκοι αποθεματικών θρεπτικών συστατικών (πρωτεΐνες, λίπη και υδατάνθρακες).

12. Ο πυρήνας είναι το κύριο μέρος του κυττάρου, που καλύπτεται εξωτερικά με πυρηνική μεμβράνη διπλής μεμβράνης διαποτισμένης από πόρους. Οι ουσίες εισέρχονται στον πυρήνα και απομακρύνονται από αυτόν μέσω των πόρων. Τα χρωμοσώματα είναι φορείς κληρονομικών πληροφοριών σχετικά με τα χαρακτηριστικά ενός οργανισμού, τις κύριες δομές του πυρήνα, καθένα από τα οποία αποτελείται από ένα μόριο DNA σε συνδυασμό με πρωτεΐνες. Ο πυρήνας είναι η θέση σύνθεσης DNA, mRNA και rRNA.

Διαφορική φυγοκέντρηση
Για τη λήψη κυτταρικών κλασμάτων, χρησιμοποιούνται ευρέως διάφοροι τύποι φυγοκέντρησης: διαφορική φυγοκέντρηση, ζωνική φυγοκέντρηση και φυγοκέντρηση βαθμίδας πυκνότητας ισορροπίας. Θεωρητικά και πρακτικά ζητήματα που σχετίζονται με τη φυγοκέντρηση συζητούνται διεξοδικά στην ανασκόπηση του Sykes.
Στην περίπτωση της διαφορικής φυγοκέντρησης, τα δείγματα φυγοκεντρούνται για ορισμένο χρόνο σε δεδομένο
όχι
ταχύτητα, μετά την οποία αφαιρείται το υπερκείμενο. Αυτή η μέθοδος είναι χρήσιμη για τον διαχωρισμό σωματιδίων που ποικίλλουν ευρέως ως προς τους ρυθμούς καθίζησης. Για παράδειγμα, η φυγοκέντρηση για 5-10 λεπτά στα 3000-5000 g οδηγεί στην καθίζηση ανέπαφων βακτηριακών κυττάρων, ενώ η πλειονότητα των θραυσμάτων κυττάρων παραμένει στο υπερκείμενο. Θραύσματα κυτταρικού τοιχώματος και δομές μεγάλων μεμβρανών μπορούν να σφαιροποιηθούν με φυγοκέντρηση στα 20.000-50.000 g για 20 λεπτά, ενώ τα μικρά κυστίδια μεμβράνης και τα ριβοσώματα απαιτούν φυγοκέντρηση στα 200.000 g για 1 ώρα για να σφαιροποιηθούν.
Ζωνική φυγοκέντρηση
Η ζωνική φυγοκέντρηση είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τον διαχωρισμό δομών που έχουν παρόμοιες πυκνότητες άνωσης αλλά διαφέρουν ως προς το σχήμα και τη μάζα των σωματιδίων. Παραδείγματα περιλαμβάνουν τον διαχωρισμό ριβοσωμικών υπομονάδων, διαφορετικών τάξεων πολυσωμάτων και μορίων DNA διαφορετικών σχημάτων. Η φυγοκέντρηση πραγματοποιείται είτε σε ρότορες με κάδο είτε σε ειδικά σχεδιασμένους ζωνικούς ρότορες. Για να αποφευχθεί η μεταφορά κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, δημιουργείται μια ασθενής κλίση (συνήθως σακχαρόζη) στα ποτήρια ζέσεως του ρότορα του κάδου ή στο θάλαμο του ζωνικού ρότορα. Το δείγμα εφαρμόζεται με τη μορφή ζώνης ή στενής λωρίδας στην κορυφή της στήλης κλίσης. Για τα υποκυτταρικά σωματίδια, χρησιμοποιείται τυπικά μια βαθμίδα σακχαρόζης από 15 έως 40% (β/ο). Τα περισσότερα από αυτά τα σωματίδια διαχωρίζονται επαρκώς με φυγοκέντρηση στα 100.000 g για 1-4 ώρες.
Φυγοκέντρηση βαθμίδας πυκνότητας ισορροπίας
Σε αυτόν τον τύπο φυγοκέντρησης, τα σωματίδια διαχωρίζονται με πυκνότητα άνωσης παρά με ταχύτητα καθίζησης. Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για τον διαχωρισμό διαφορετικών κλασμάτων μεμβράνης, καθώς τα θραύσματα μεμβράνης που ανήκουν στον ίδιο τύπο μπορεί να ποικίλλουν πολύ σε μέγεθος (και επομένως ρυθμό καθίζησης), αλλά πρέπει να έχουν την ίδια πυκνότητα άνωσης. Τα συστατικά υπό μελέτη κινούνται κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης στη βαθμίδα πυκνότητας της διαλυμένης ουσίας (για μεμβράνες και οργανίδια με πυκνότητα κάτω από
Συνήθως χρησιμοποιούνται βαθμίδες σακχαρόζης g/ml και για πυκνότερες δομές όπως ιοί, άλατα τρυγικού οξέος και χλωριούχο καίσιο) μέχρι να επιτευχθεί μια θέση ισορροπίας στην οποία η πυκνότητα κάθε σωματιδίου είναι ίση με την πυκνότητα του περιβάλλοντος διαλύματος. Επειδή τα διαλύματα σακχαρόζης είναι σχετικά παχύρρευστα, συνήθως σχηματίζονται βαθμίδες εκ των προτέρων. Τα διαλύματα χλωριούχου καισίου έχουν χαμηλό ιξώδες, επομένως είναι δύσκολο να παρασκευαστεί εκ των προτέρων ένα διάλυμα βαθμίδωσης. Σε αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιείται η τεχνική της ισοπυκνικής φυγοκέντρησης με κλίση πυκνότητας. Το δείγμα αναμιγνύεται με χλωριούχο καίσιο σε ποσότητα επαρκή για να δημιουργηθεί πυκνότητα ίση με τη μέση πυκνότητα των υποκυτταρικών σωματιδίων. Αυτό το ομοιογενές μείγμα τοποθετείται σε ένα δοχείο για φυγοκέντρηση και ως αποτέλεσμα της καθίζησης του χλωριούχου καισίου στο πεδίο των φυγόκεντρων δυνάμεων κατά τη φυγοκέντρηση, σχηματίζεται η κλίση του.
Δεδομένου ότι ο ρυθμός καθίζησης ενός σωματιδίου μειώνεται σταδιακά καθώς φθάνει στην περιοχή της βαθμίδας όπου έχει την ίδια πυκνότητα με το διάλυμα, η φυγοκέντρηση απαιτεί πολύ μεγάλο χρόνο για να επιτευχθεί ισορροπία. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για μικρά κυστίδια μεμβράνης, όπως τα χρωματοφόρα, ή για θραύσματα κυτταροπλασματικών μεμβρανών κυττάρων που διασπώνται από γαλλική πρέσα, καθώς ο ρυθμός καθίζησης αυτών των σωματιδίων είναι χαμηλός ακόμη και απουσία βαθμίδωσης. Εάν χρησιμοποιείτε φυγόκεντρες επιταχύνσεις της τάξης των 100.000-200.000 g, απαιτούνται τουλάχιστον 24 ώρες για περισσότερο ή λιγότερο καλό διαχωρισμό και 72 ώρες για πλήρη διαχωρισμό.
Διαβαθμίσεις σακχαρόζης
Η συγκέντρωση της σακχαρόζης σε διαλύματα για την παρασκευή βαθμίδωσης υποδεικνύεται στη βιβλιογραφία με διάφορους τρόπους: σε μονάδες πυκνότητας, σε mole σακχαρόζης, σε ποσοστό βάρους σακχαρόζης (w/w), σε ποσοστό ανά μονάδα όγκου (w/v ή g /100 ml). Τα τυπικά βιβλία αναφοράς χημικών περιέχουν πίνακες για τη μετατροπή των συγκεντρώσεων υδατικών διαλυμάτων σακχαρόζης από τη μια μονάδα στην άλλη. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα ποσοστά βάρους είναι η σακχαρόζη. Κατά την παρασκευή διαλυμάτων σακχαρόζης, η πυκνότητα του νερού ή των αραιωμένων ρυθμιστικών διαλυμάτων θεωρείται ότι είναι 1 g/ml. Επομένως, για να παρασκευάσετε, για παράδειγμα, διάλυμα σακχαρόζης 54% (w/w), πρέπει να διαλύσετε 54 g σακχαρόζης σε 46 ml νερού. Αυτό παράγει 100 g διαλύματος και δεδομένου ότι η πυκνότητα του διαλύματος σακχαρόζης 54% (w/w) είναι 1,2451, ο τελικός όγκος θα είναι 80,3 mL. Η παρασκευή διαλυμάτων με αυτόν τον τρόπο εξαλείφει την ανάγκη να φέρουμε τα ιξώδη διαλύματα σε σταθερές τιμές όγκου.
Για τη δημιουργία διαβαθμίσεων, η βιομηχανία παράγει μια ποικιλία συσκευών, αλλά η χρήση τους δεν είναι απαραίτητη, καθώς μπορούν να παρασκευαστούν ικανοποιητικές ποιοτικές διαβαθμίσεις τοποθετώντας μια σειρά διαλυμάτων σακχαρόζης το ένα πάνω στο άλλο σε ένα ποτήρι ζέσεως φυγοκέντρου και αφήνοντάς τα όλη τη νύχτα, έτσι ώστε μια συνεχής σχηματίζεται κλίση λόγω της διάχυσης. Δεν χρειάζεται να διατηρηθούν βαθμίδες που θα φυγοκεντρηθούν για 24 ώρες ή περισσότερο, αφού κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης θα σχηματιστεί μια συνεχής κλίση λόγω της διάχυσης. Συνήθως ετοιμάζουμε κλίσεις από πέντε έως επτά στρώσεις. Όταν χρησιμοποιούνται βρεγμένα ποτήρια, όπως αυτά από νιτροκυτταρίνη ή πολυανθρακικό, τα στρώματα μπορούν να εφαρμοστούν επιτρέποντάς τους να ρέουν κάτω από το τοίχωμα του ποτηριού από μια πιπέτα που κρατιέται υπό γωνία προς το τοίχωμα. Εάν χρησιμοποιούνται μη βρεγμένα ποτήρια ζέσεως, όπως ποτήρια ζέσεως από πολυαλομερές ή πολυπροπυλένιο, το άκρο της πιπέτας θα πρέπει να έρχεται σε επαφή με τον μηνίσκο κατά την προσθήκη του διαλύματος, έτσι ώστε να μην γίνεται ανάμειξη.
Η απλούστερη μέθοδος για την επιλογή κλασμάτων από βαθμίδες σακχαρόζης είναι η άντλησή τους χρησιμοποιώντας μια περισταλτική αντλία. Το ποτήρι ζέσεως φυγόκεντρου σφίγγεται σε στρογγυλά νύχια (χρησιμοποιούμε ένα κομμάτι διαφανές πλεξιγκλάς με τρύπα διάτρητο κατά μήκος του ποτηριού, το οποίο σφίγγουμε στα νύχια) και ένας σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα μικρής διαμέτρου στερεώνεται πάνω του στα στρογγυλά νύχια . Ο σωλήνας συνδέεται με την αντλία και χαμηλώνει στο γυαλί μέχρι να αγγίξει το κάτω μέρος. Στη συνέχεια, η στήλη κλίσης ανασκάπτεται χρησιμοποιώντας μια αντλία στους σωλήνες μέτρησης που βρίσκονται στον συλλέκτη κλασμάτων.
Απορρυπαντικά
Τα απορρυπαντικά χρησιμοποιούνται στην κλασμάτωση των κυττάρων με τρεις τρόπους. Όταν κάποιος θέλει να αποκτήσει οργανίδια μη μεμβράνης, όπως ριβοσώματα, νουκλεοειδή κ.λπ., τα απορρυπαντικά παρέχουν ήπια κυτταρική λύση μετά από διαταραχή της ακεραιότητας της μουρεΐνης (θετικά κατά Gram βακτήρια) ή της εξωτερικής μεμβράνης (αρνητικά βακτήρια κατά Gram). Τα απορρυπαντικά χρησιμοποιούνται επίσης για την επιλεκτική διάλυση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, διατηρώντας την εξωτερική μεμβράνη ανέπαφη ή για την αφαίρεση της μόλυνσης της μεμβράνης με ριβοσώματα, πολυσώματα και τα τοιχώματα των θετικών κατά Gram κυττάρων.
Τα απορρυπαντικά είναι αμφίπαθα μόρια, δηλαδή μόρια που έχουν υδρόφιλες και υδρόφοβες περιοχές. είναι μέτρια διαλυτά στο νερό. Σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, τα απορρυπαντικά σχηματίζουν ένα πραγματικό διάλυμα στο νερό. Καθώς η συγκέντρωση αυξάνεται, τα μόρια του απορρυπαντικού συσσωματώνονται για να σχηματίσουν μικκύλια, σε καθεμία από τις οποίες οι υδρόφιλες περιοχές βλέπουν το νερό και οι υδρόφοβες κρύβονται από το νερό μέσα στο μικκύλλιο. Η συγκέντρωση στην οποία αρχίζουν να σχηματίζονται μικκύλια καθώς προστίθεται απορρυπαντικό στο νερό ονομάζεται κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλίων (CMC). Κάθε απορρυπαντικό χαρακτηρίζεται από το δικό του CMC, το μέγεθος και το σχήμα των μικκυλίων. Μια εξαιρετική ανασκόπηση από τους Helenius και Simons συνοψίζει τις ιδιότητες πολλών απορρυπαντικών που χρησιμοποιούνται για τη λήψη κυτταρικών κλασμάτων.
Τα απορρυπαντικά μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες, που διαφέρουν ως προς τις ιδιότητες των μικκυλίων, την ικανότητα σύνδεσης με πρωτεΐνες και την ικανότητα αλληλεπίδρασης με άλλες διαλυμένες ουσίες. Αυτές οι κατηγορίες περιλαμβάνουν ιοντικά απορρυπαντικά, μη ιοντικά απορρυπαντικά και χολικά άλατα. Κάθε απορρυπαντικό έχει τις δικές του προκλήσεις και πλεονεκτήματα κατά την κλασμάτωση των κυττάρων.
Ιονικά απορρυπαντικά
Τα πιο κοινά ιοντικά απορρυπαντικά περιλαμβάνουν δωδεκυλοθειικό νάτριο (λαυρυλοθειικό νάτριο, SDS), Ν-λαυρυλοσαρκοσινικό νάτριο (Sarkosyl), βενζοσουλφονικά αλκυλεστέρα (κοινά οικιακά απορρυπαντικά) και άλατα τεταρτοταγούς αμίνης όπως βρωμιούχο κετυλοτριμεθυλαμμώνιο (κεταυλόνη). Τα ιοντικά απορρυπαντικά τείνουν να σχηματίζουν μικρά μικκύλια (με μοριακό βάρος 10.000) και έχουν σχετικά υψηλό CMC (για SDS, το CMC σε θερμοκρασία δωματίου σε αραιωμένα ρυθμιστικά διαλύματα είναι περίπου 0,2%). Η CMC και η διαλυτότητα των ιοντικών απορρυπαντικών επηρεάζονται έντονα από την ιοντική ισχύ του διαλύματος και τη φύση των αντίθετων ιόντων που υπάρχουν σε αυτό. Για παράδειγμα, ένα διάλυμα SDS 10% γίνεται ασταθές σε θερμοκρασία περίπου 17 °C, ενώ ένα παρόμοιο διάλυμα θειικού δωδεκυλεστέρα στο Tris είναι σταθερό στους 0 °C. Το δωδεκυλοθειικό κάλιο είναι διαλυτό μόνο σε υψηλές θερμοκρασίες και επομένως το K+ θα πρέπει να αποκλείεται από όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα όταν χρησιμοποιείται αυτό το απορρυπαντικό.
Τα απορρυπαντικά όπως το SDS, τα οποία έχουν μια εξαιρετικά ιονισμένη υδρόφιλη ομάδα, δεν επηρεάζονται από αλλαγές στην αντίδραση του μέσου σε μεγάλο εύρος pH και δεν καθιζάνουν από τριχλωροξικό οξύ 5%. Τα ιοντικά απορρυπαντικά συνδέονται ισχυρά με τις πρωτεΐνες και στην περίπτωση του SDS, συνήθως συμβαίνει ξεδίπλωμα και μη αναστρέψιμη μετουσίωση των μορίων πρωτεΐνης. Αν και τα ιοντικά απορρυπαντικά μπορούν να αφαιρεθούν με αιμοκάθαρση, αυτό γενικά δεν γίνεται λόγω της σημαντικής δέσμευσής τους σε πρωτεΐνες.
Μη ιονικά απορρυπαντικά
Τα μη ιονικά απορρυπαντικά περιλαμβάνουν Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Tween 80 και οκτυλογλυκοσίδη. Τυπικά, τα μικκύλια αυτών των απορρυπαντικών έχουν υψηλό μοριακό βάρος (50.000 ή περισσότερο) και χαμηλό CMC (0,1% ή λιγότερο), γεγονός που περιορίζει τη δυνατότητα εφαρμογής τους στη διήθηση γέλης ή στην ηλεκτροφόρηση γέλης. Οι ιδιότητες αυτών των απορρυπαντικών στο διάλυμα δεν επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από την αντίδραση των μέσων και την ιοντική ισχύ, αν και μπορεί να καθιζάνουν από 5% τριχλωροξικό οξύ. Τα μη ιονικά απορρυπαντικά συνδέονται μόνο με υδρόφοβες πρωτεΐνες και γενικά δεν προκαλούν μετουσίωση ή απώλεια βιολογικής δραστηριότητας.
Χολικά άλατα
Τα χολικά άλατα είναι άλατα παραγώγων στερόλης, για παράδειγμα χολικό, δεοξυχολικό ή ταυροχολικό νάτριο. Επειδή οι τεράστιοι πυρήνες στερόλης δεν συσκευάζονται καλά, αυτά τα απορρυπαντικά σχηματίζουν μικρά μικκύλια (συχνά με λίγα μόνο μόρια) και το μοριακό βάρος των τελευταίων, σε αντίθεση με άλλα απορρυπαντικά, είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του απορρυπαντικού. Δεδομένου ότι αυτά τα απορρυπαντικά είναι άλατα πολύ κακώς διαλυτών οξέων με τιμές pKa στην περιοχή από 6,5-7,5, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε περιοχές αλκαλικού pH. Για να αποφευχθούν δυσκολίες με τη διάλυση, χρησιμοποιούνται συμπυκνωμένα μητρικά διαλύματα, τα οποία παρασκευάζονται με διάλυση του αντίστοιχου ελεύθερου οξέος σε περίσσεια NaOH. Όταν εργάζεστε με αυτά τα απορρυπαντικά, η ιοντική σύνθεση, η τιμή pH και η συνολική συγκέντρωση απορρυπαντικού πρέπει να διατηρούνται σε σταθερά επίπεδα.
Προβλήματα,
που προκύπτουν από τη χρήση απορρυπαντικών
Επειδή τα περισσότερα απορρυπαντικά χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις πολύ πάνω από το CMC και επειδή τα απορρυπαντικά δρουν σχηματίζοντας μικτά μικκύλια με λιπίδια ή δεσμεύοντας με πρωτεΐνες, οι αναλογίες απορρυπαντικού:πρωτεΐνης ή απορρυπαντικού-λιπιδίου είναι πολύ πιο σημαντικές από την πραγματική συγκέντρωση απορρυπαντικού. Τυπικά, παρέχεται επαρκής περίσσεια απορρυπαντικού σε αναλογία 2-4 mg απορρυπαντικού προς 1 mg πρωτεΐνης. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείται 2% Triton X-100 για τη διαλυτοποίηση μεμβρανών, η συγκέντρωση πρωτεΐνης στο δείγμα δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 5-10 mg/ml.
Το Triton X-100, ένα από τα πιο πολύτιμα μη ιονικά απορρυπαντικά, θέτει προκλήσεις για τις μετρήσεις πρωτεΐνης επειδή περιέχει ένα αρωματικό υπόλειμμα που παρεμβαίνει στις μετρήσεις απορρόφησης στα 280 nm και παράγει ένα θολό ίζημα σε χημικά δείγματα. Συνήθως ξεπερνάμε αυτή τη δυσκολία επισημαίνοντας την καλλιέργεια με μια μικρή ποσότητα 3Η-λευκίνης. Εάν η ετικέτα εισάγεται σε ένα ελάχιστο ή συνθετικό μέσο αλατιού, θα πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να προστεθεί επαρκής ποσότητα μη επισημασμένης λευκίνης για να διασφαλιστεί η σταθερή συμπερίληψη του ισοτόπου ανά 1 mg πρωτεΐνης καθ' όλη την περίοδο ανάπτυξης. Για το E. coli, αρκεί να προστεθούν 20-40 μg μη επισημασμένης λευκίνης ως όχημα για να επιτευχθεί ομοιόμορφη ενσωμάτωση της ετικέτας. Όταν είναι αδύνατο να εισαχθεί μια ετικέτα για κάποιο λόγο, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετράται επίσης παρουσία Triton X-100 χρησιμοποιώντας την τροποποιημένη μέθοδο Lowry που περιγράφεται στο [P]. οπότε στο δείγμα προστίθεται περίσσεια SDS. Το τελευταίο σχηματίζει σταθερά μικτά μικκύλια με τρίτονα που δεν παρεμβαίνουν στις μετρήσεις.
Το Triton X-100 και άλλα παρόμοια μη ιονικά απορρυπαντικά διαλύονται σε μείγματα νερού-αλκοόλης και οι πρωτεΐνες από τέτοια μείγματα μπορούν να απομονωθούν με καθίζηση σε αιθανόλη. Το δείγμα τοποθετείται σε πάγο και προστίθενται με ανάδευση 2 όγκοι παγωμένης με πάγο απόλυτης αιθανόλης. Το μίγμα διατηρείται όλη τη νύχτα στην κατάψυξη και το ίζημα πρωτεΐνης συλλέγεται με φυγοκέντρηση. Για αποτελεσματική καθίζηση, απαιτείται συγκέντρωση πρωτεΐνης τουλάχιστον 0,2 mg/ml. Τα αραιωμένα διαλύματα πρωτεΐνης συμπυκνώνονται σε μια συσκευή υπερδιήθησης Amicon χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο PM-30. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι αυτό συγκεντρώνει επίσης τα μικκύλια του απορρυπαντικού.
Το SDS απομακρύνεται από τα δείγματα με καθίζηση με ακετόνη. Έξι όγκοι άνυδρης ακετόνης προστίθενται στο δείγμα σε θερμοκρασία δωματίου και το ίζημα που σχηματίζεται διαχωρίζεται με φυγοκέντρηση. Το ίζημα πλένεται αρκετές φορές με ένα μίγμα νερού-ακετόνης (b-1). Δεδομένου ότι το ίζημα είναι συχνά κηρώδες και δύσκολο στον χειρισμό, συνήθως το διασκορπίζουμε σε νερό με ομογενοποιητή Potter και στη συνέχεια το λυοφιλοποιούμε.
Ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου
Η ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου είναι η απλούστερη και πιο αποτελεσματική μέθοδος για τον εντοπισμό του εύρους πολυπεπτιδίων που υπάρχουν σε υποκυτταρικά κλάσματα. Αυτή η μέθοδος πλέον σε πολλές περιπτώσεις αντικαθιστά την ενζυματική και χημική ανάλυση για τον καθορισμό της καθαρότητας και της ομοιογένειας των υποκυτταρικών κλασμάτων.
Για την ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου, χρησιμοποιούνται διάφορες συσκευές που παράγονται στο εμπόριο και οικιακά. Προτιμούμε όργανα που επιτρέπουν το διαχωρισμό σε λεπτές πλάκες γέλης για βέλτιστη ανάλυση. Η καλύτερη ανάλυση στις πλάκες οφείλεται στο γεγονός ότι η θερμότητα που παράγεται κατά την ηλεκτροφόρηση διαχέεται εύκολα εδώ, και επίσης επειδή η γέλη μετά την ηλεκτροφόρηση μπορεί να σταθεροποιηθεί γρήγορα. Το τελευταίο είναι σημαντικό για την ελαχιστοποίηση της διάχυσης πρωτεΐνης στις ρίγες. Οι πλάκες επιτρέπουν τη σύγκριση πολλών δειγμάτων ταυτόχρονα και αποθηκεύονται εύκολα μετά την ξήρανση σε φύλλα διηθητικού χαρτιού. Η ραδιενέργεια στα δείγματα ανιχνεύεται με αυτοραδιογραφία και φωτοφθορογραφία, και τα πηκτώματα που έχουν στεγνώσει σε διηθητικό χαρτί μπορούν εύκολα να κοπούν με ψαλίδι ή κόφτη και, αφού ξανακορεσθούν οι κομμένες ξηρές λωρίδες με νερό, να μετρηθούν σε μετρητή σπινθηρισμού. Εάν δεν απαιτείται εκτεταμένη απόσταξη στο πήκτωμα, μπορεί να πραγματοποιηθεί ηλεκτροφόρηση, στερέωση, χρώση και ξήρανση σε μία ημέρα.
Ένα ευρύ φάσμα ρυθμιστικών συστημάτων είναι διαθέσιμο για ηλεκτροφόρηση γέλης παρουσία SDS. Η καλύτερη ανάλυση παρέχεται από συστήματα συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος, στα οποία το άνω ρυθμιστικό διάλυμα (ηλεκτρόδιο) περιέχει ιόντα που έχουν υψηλή κινητικότητα και κινούνται μέσω της γέλης με τη μορφή μπροστινής ζώνης ή μπροστινής πλευράς. Μέχρι να εισέλθουν στο διαχωριστικό πήκτωμα, οι πρωτεΐνες συμπιέζονται από αυτό το κινούμενο μέτωπο σε μια στενή λωρίδα και αφού εισέλθουν σε αυτό, καθυστερούν λόγω του γεγονότος ότι το πήκτωμα έχει τις ιδιότητες «κόσκινου». Το σύστημα που περιγράφεται παρακάτω είναι μια τροποποίηση του συστήματος ρυθμιστικού διαλύματος συμπύκνωσης που προτείνεται από τον Laemli. Βλέπε επίσης Ενότητα. 26.5.1.
Η γέλη διαχωρισμού ή επιτάχυνσης περιέχει 11,5% ακρυλαμίδιο, 0,2% δισακρυλαμίδιο και 0,1% SDS σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris 0,375 Μ ρυθμισμένο με HC1 σε ρΗ 8,8. Ο πολυμερισμός ξεκινά με την αφαίρεση του αέρα από το διάλυμα και την προσθήκη τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνης (έως 0,8%) και υπερθειικού αμμωνίου (έως 0,015%). Μέχρι να συμβεί ο πολυμερισμός, το διαχωριστικό πήκτωμα διατηρείται κάτω από ένα στρώμα νερού. Το νερό χύνεται έξω και ένα πήκτωμα συγκέντρωσης ή εφαρμογής που περιέχει 4,5% ακρυλαμίδιο, 0,12% δισακρυλαμίδιο και 0,1% SDS σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris 0,125 Μ ρυθμισμένο σε ρΗ 6,8 με HC1 επιστρώνεται. Αυτό το πήκτωμα πολυμερίζεται με προσθήκη τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνης (έως 0,125%) και υπερθειικού αμμωνίου (έως 0,05%). Πριν από τον πολυμερισμό, μια χτένα από Teflon (φθοροπλαστικό) εισάγεται στη συμπυκνωτική γέλη για να σχηματιστούν φρεάτια δείγματος. Μετά τον πολυμερισμό, τα προκύπτοντα φρεάτια πλένονται πολλές φορές με ρυθμιστικό ηλεκτροδίου που περιέχει μικρή ποσότητα μπλε βρωμοφαινόλης. Αυτό αφαιρεί το υπερθειικό που δεν αντέδρασε και λερώνει ελαφρά τα όρια του φρεατίου έτσι ώστε να είναι ορατά όταν εφαρμόζονται τα δείγματα. Το ρυθμιστικό διάλυμα άνω ηλεκτροδίου περιέχει 0,182 Μ γλυκίνη, 0,0255 Μ Tris (τελικό pH 8,3) και 0,1% SDS. Το ρυθμιστικό διάλυμα κάτω ηλεκτροδίου περιέχει τα ίδια εξαρτήματα, εκτός από το SDS.
Τα δείγματα διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα συμπύκνωσης γέλης στο οποίο έχουν προστεθεί 12,5% γλυκερόλη, 1,25% SDS και 1,25% 2-μερκαπτοαιθανόλη. Πριν από την ηλεκτροφόρηση, θερμαίνονται για 5 λεπτά σε λουτρό ζέοντος νερού για να εξασφαλιστεί η πλήρης διάσπαση και μετουσίωση όλων των πρωτεϊνών. Το μπλε της βρωμοφαινόλης ή το κόκκινο της φαινόλης μπορούν να προστεθούν στα δείγματα ως ετικέτα βαφής. Τα τελικά παρασκευασμένα δείγματα πρέπει να περιέχουν 1-5 mg/ml πρωτεΐνης και αρκεί να προστεθούν 5-25 μg πρωτεΐνης σε μικρά φρεάτια (3Χ0,75 mm). Δεδομένου ότι η αγωγιμότητα της γέλης αλλάζει καθώς το ρυθμιστικό διάλυμα συγκέντρωσης περνά μέσα από αυτό, η τάση ή η ισχύς θα πρέπει να διατηρούνται σταθερές και όχι το ρεύμα.
Μέχρι να εισέλθει το υπό μελέτη μείγμα στη διαχωριστική γέλη, η αρχική τάση ρυθμίζεται στα 50 V. τότε η τάση αυξάνεται στα 145 V για το υπόλοιπο της διαδρομής. Για καλύτερη ανάλυση, η θερμοκρασία της γέλης πρέπει να είναι 25°C.
Το πιο κοινό μειονέκτημα της ηλεκτροφόρησης πολυακρυλαμιδίου είναι η κάμψη των ταινιών λόγω ακατάλληλου πολυμερισμού. Για να αποφευχθεί αυτό, τα διαλύματα γέλης πρέπει να απαερωθούν καλά πριν από την έκχυση και το άνω άκρο της διαχωριστικής γέλης πρέπει να πλυθεί αρκετές φορές μετά τον πολυμερισμό για να αφαιρεθούν όλα τα υπολείμματα μη πολυμερισμένης γέλης. Τα αντιδραστήρια για ηλεκτροφόρηση ποικίλλουν σε καθαρότητα και για να είναι πάντα σταθερός ο χρόνος πολυμερισμού, είναι απαραίτητο να αυξηθεί ή να μειωθεί η ποσότητα υπερθειικού αμμίου. Για ένα διαχωριστικό πήκτωμα, ο βέλτιστος χρόνος πολυμερισμού είναι ~30 λεπτά. Με μεγαλύτερη διάρκεια, το πήκτωμα γίνεται μαλακό ή δεν πολυμερίζεται πλήρως και με μικρότερη διάρκεια, ο πολυμερισμός μπορεί να προχωρήσει άνισα, γεγονός που θα οδηγήσει στην εμφάνιση κυματιστών πρωτεϊνικών λωρίδων. Το υπερθειικό αμμώνιο είναι πολύ υγροσκοπικό και δεν είναι σταθερό. Συνιστάται η παρασκευή μητρικού συμπυκνωμένου διαλύματος υπερθειικού αμμωνίου (50 mg/ml), το οποίο αποθηκεύεται κατεψυγμένο σε δόσεις του 1 ml. Αυτό το διάλυμα είναι σταθερό στην κατάψυξη για αρκετούς μήνες.
Οι ταινίες μπορεί επίσης να λερωθούν λόγω λιπιδίων και γλυκολιπιδίων που υπάρχουν στο δείγμα (μια συνηθισμένη περίπτωση είναι η παρουσία λιποπολυσακχαριτών). Τα λιπίδια δεσμεύουν ένα σημαντικό μέρος του SDS και στην πραγματικότητα η παρουσία τους μπορεί να εξαντλήσει το SDS που είναι διαθέσιμο για σύνδεση με πρωτεΐνες που μεταναστεύουν στο πήκτωμα. Αυτή η δυσκολία ξεπερνιέται αυξάνοντας την ποσότητα SDS στο ρυθμιστικό διάλυμα του άνω ηλεκτροδίου στο 1% ή υψηλότερο.
Τα πηκτώματα χρωματίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο των Feuerbanks et al. Με ήπια ανάδευση, τα πηκτώματα εμποτίζονται για 1 ώρα σε καθένα από τα ακόλουθα διαλύματα: 1) 525 ml ισοπροπανόλης 95%, 200 ml παγόμορφου οξικού οξέος, 1,0 g φωτεινού μπλε Coomassie και 1275 ml νερού. 2) 210 ml ισοπροπανόλης 95%, 200 ml παγόμορφου οξικού οξέος, 0,1 g Coomassie φωτεινό μπλε και 1590 ml νερού. 3) 200 ml παγόμορφο οξικό οξύ, 0,05 g Coomassie φωτεινό μπλε και 1800 ml νερό και 4) 10% οξικό οξύ. Αφού αποχρωματιστεί τελείως η γέλη, εμποτίζεται πριν από την ξήρανση σε οξικό οξύ 10% που περιέχει 1% γλυκερίνη.

Τι είναι η φυγοκέντρηση; Σε τι χρησιμεύει η μέθοδος; Ο όρος "φυγοκέντρηση" σημαίνει το διαχωρισμό υγρών ή στερεών σωματιδίων μιας ουσίας σε διάφορα κλάσματα χρησιμοποιώντας φυγόκεντρες δυνάμεις. Αυτός ο διαχωρισμός των ουσιών πραγματοποιείται με τη χρήση ειδικών συσκευών - φυγοκεντρητών. Ποια είναι η αρχή της μεθόδου;

Αρχή φυγοκέντρησης

Ας δούμε τον ορισμό με περισσότερες λεπτομέρειες. Η φυγοκέντρηση είναι η επίδραση σε ουσίες μέσω περιστροφής εξαιρετικά υψηλής ταχύτητας σε μια εξειδικευμένη συσκευή. Το κύριο μέρος κάθε φυγόκεντρου είναι ο ρότορας, ο οποίος περιέχει φωλιές για την εγκατάσταση δοκιμαστικών σωλήνων με υλικό που υπόκειται σε διαχωρισμό σε ξεχωριστά κλάσματα. Όταν ο ρότορας περιστρέφεται με υψηλές ταχύτητες, οι ουσίες που τοποθετούνται στους δοκιμαστικούς σωλήνες διαχωρίζονται σε διαφορετικές ουσίες ανάλογα με το επίπεδο πυκνότητας. Για παράδειγμα, η φυγοκέντρηση δειγμάτων υπόγειων υδάτων διαχωρίζει το υγρό και καθιζάνει τα στερεά σωματίδια που περιέχει.

Συγγραφέας της μεθόδου

Για πρώτη φορά έγινε γνωστό τι είναι η φυγοκέντρηση μετά από πειράματα που διεξήγαγε ο επιστήμονας A.F. Lebedev. Η μέθοδος αναπτύχθηκε από έναν ερευνητή για τον προσδιορισμό της σύστασης του νερού του εδάφους. Προηγουμένως, για τους σκοπούς αυτούς, χρησιμοποιήθηκε καθίζηση υγρού με επακόλουθο διαχωρισμό στερεών δειγμάτων από αυτό. Η ανάπτυξη της μεθόδου φυγοκέντρησης κατέστησε δυνατή την αντιμετώπιση αυτού του έργου πολύ πιο γρήγορα. Χάρη σε αυτόν τον διαχωρισμό, κατέστη δυνατή η εξαγωγή του στερεού τμήματος των ουσιών από ένα υγρό σε ξηρή μορφή μέσα σε λίγα λεπτά.

Βήματα φυγοκέντρησης

Η διαφορική φυγοκέντρηση ξεκινά με την καθίζηση ουσιών που υπόκεινται σε έρευνα. Αυτή η επεξεργασία υλικού λαμβάνει χώρα σε συσκευές καθίζησης. Κατά την καθίζηση, τα σωματίδια της ύλης διαχωρίζονται υπό την επίδραση της βαρύτητας. Αυτό σας επιτρέπει να προετοιμάσετε ουσίες για καλύτερο διαχωρισμό χρησιμοποιώντας φυγόκεντρες δυνάμεις.

Στη συνέχεια, οι ουσίες στους δοκιμαστικούς σωλήνες υποβάλλονται σε διήθηση. Σε αυτό το στάδιο χρησιμοποιούνται τα λεγόμενα διάτρητα τύμπανα, τα οποία προορίζονται για τον διαχωρισμό υγρών σωματιδίων από στερεά. Κατά τη διάρκεια των δραστηριοτήτων που παρουσιάζονται, όλο το ίζημα παραμένει στα τοιχώματα της φυγόκεντρου.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου

Σε σύγκριση με άλλες μεθόδους που στοχεύουν στον διαχωρισμό μεμονωμένων ουσιών, όπως η διήθηση ή η καθίζηση, η φυγοκέντρηση καθιστά δυνατή τη λήψη ενός ιζήματος με ελάχιστη περιεκτικότητα σε υγρασία. Η χρήση αυτής της μεθόδου διαχωρισμού επιτρέπει τον διαχωρισμό λεπτών εναιωρημάτων. Το αποτέλεσμα είναι η παραγωγή σωματιδίων μεγέθους 5-10 microns. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα της φυγοκέντρησης είναι η δυνατότητα εκτέλεσης με χρήση εξοπλισμού μικρών όγκων και διαστάσεων. Το μόνο μειονέκτημα της μεθόδου είναι η υψηλή κατανάλωση ενέργειας των συσκευών.

Η φυγοκέντρηση στη βιολογία

Στη βιολογία, ο διαχωρισμός των ουσιών σε μεμονωμένες ουσίες καταφεύγει όταν είναι απαραίτητο να προετοιμαστούν σκευάσματα για εξέταση στο μικροσκόπιο. Η φυγοκέντρηση εδώ πραγματοποιείται με τη χρήση πολύπλοκων συσκευών - κυτοροτέρ. Εκτός από τις υποδοχές για δοκιμαστικούς σωλήνες, τέτοιες συσκευές είναι εξοπλισμένες με θήκες δειγμάτων και κάθε είδους διαφάνειες πολύπλοκου σχεδιασμού. Ο σχεδιασμός της φυγόκεντρου κατά τη διεξαγωγή έρευνας στη βιολογία επηρεάζει άμεσα την ποιότητα των υλικών που λαμβάνονται και, κατά συνέπεια, την ποσότητα των χρήσιμων πληροφοριών που μπορούν να συλλεχθούν από τα αποτελέσματα της ανάλυσης.

Φυγοκέντρηση στη βιομηχανία διύλισης πετρελαίου

Η μέθοδος φυγοκέντρησης είναι απαραίτητη στην παραγωγή λαδιού. Υπάρχουν ορυκτά υδρογονανθράκων από τα οποία το νερό δεν απελευθερώνεται πλήρως κατά την απόσταξη. Η φυγοκέντρηση καθιστά δυνατή την απομάκρυνση της περίσσειας υγρού από το λάδι, αυξάνοντας την ποιότητά του. Σε αυτή την περίπτωση, το λάδι διαλύεται σε βενζόλιο, στη συνέχεια θερμαίνεται στους 60 o C και στη συνέχεια υποβάλλεται σε φυγόκεντρη δύναμη. Τέλος, μετρήστε την ποσότητα του νερού που απομένει στην ουσία και επαναλάβετε τη διαδικασία εάν χρειάζεται.

Φυγοκέντρηση αίματος

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για ιατρικούς σκοπούς. Στην ιατρική, σας επιτρέπει να λύσετε τον ακόλουθο αριθμό προβλημάτων:

Λήψη δειγμάτων καθαρού αίματος για πλασμαφαίρεση. Για τους σκοπούς αυτούς, τα σχηματισμένα στοιχεία του αίματος διαχωρίζονται από το πλάσμα του σε φυγόκεντρο. Η επέμβαση καθιστά δυνατή την απαλλαγή του αίματος από ιούς, υπερβολικά αντισώματα, παθογόνα βακτήρια και τοξίνες.
Προετοιμασία αίματος για μετάγγιση δότη. Αφού το σωματικό υγρό διαχωριστεί σε ξεχωριστά κλάσματα με φυγοκέντρηση, τα αιμοσφαίρια επιστρέφονται στον δότη και το πλάσμα χρησιμοποιείται για μετάγγιση ή καταψύχεται για μελλοντική χρήση.
Απομόνωση αιμοπεταλιακής μάζας. Η ουσία λαμβάνεται από την προκύπτουσα μάζα και χρησιμοποιείται σε χειρουργικά και αιματολογικά τμήματα ιατρικών ιδρυμάτων, σε θεραπεία έκτακτης ανάγκης και χειρουργεία. Η χρήση της αιμοπεταλιακής μάζας στην ιατρική καθιστά δυνατή τη βελτίωση της πήξης του αίματος στα θύματα.
Σύνθεση ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η φυγοκέντρηση των αιμοσφαιρίων γίνεται μέσω του λεπτού διαχωρισμού των κλασμάτων του σύμφωνα με μια ειδική τεχνική. Η τελική μάζα, πλούσια σε ερυθρά αιμοσφαίρια, χρησιμοποιείται για μετάγγιση κατά την απώλεια αίματος και τις επεμβάσεις. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια χρησιμοποιούνται συχνά για τη θεραπεία της αναιμίας και άλλων συστηματικών ασθενειών του αίματος.

Στη σύγχρονη ιατρική πρακτική, χρησιμοποιούνται πολλές συσκευές νέας γενιάς, οι οποίες καθιστούν δυνατή την επιτάχυνση ενός περιστρεφόμενου τυμπάνου σε μια ορισμένη ταχύτητα και τη διακοπή του σε μια συγκεκριμένη στιγμή. Αυτό επιτρέπει στο αίμα να διαχωριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια σε ερυθρά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια, πλάσμα, ορό και θρόμβους. Με παρόμοιο τρόπο εξετάζονται και άλλα σωματικά υγρά, συγκεκριμένα, διαχωρίζονται ουσίες στα ούρα.

Φυγόκεντροι: κύριοι τύποι

Καταλάβαμε τι είναι η φυγοκέντρηση. Τώρα ας μάθουμε ποιες συσκευές χρησιμοποιούνται για την εφαρμογή της μεθόδου. Οι φυγόκεντροι μπορούν να είναι κλειστοί ή ανοιχτοί, μηχανικά ή χειροκίνητα. Το κύριο μέρος εργασίας των φορητών ανοιχτών οργάνων είναι ένας περιστρεφόμενος άξονας που βρίσκεται κατακόρυφα. Στο πάνω μέρος του υπάρχει μια κάθετα σταθερή μπάρα όπου βρίσκονται κινητά μεταλλικά μανίκια. Περιέχουν ειδικούς δοκιμαστικούς σωλήνες που στενεύουν στο κάτω μέρος. Βαμβάκι τοποθετείται στο κάτω μέρος των μανικιών, το οποίο αποφεύγει τη φθορά του γυάλινου δοκιμαστικού σωλήνα όταν έρχεται σε επαφή με μέταλλο. Στη συνέχεια, η συσκευή τίθεται σε κίνηση. Μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, το υγρό διαχωρίζεται από τα αιωρούμενα στερεά. Μετά από αυτό, η χειροκίνητη φυγόκεντρος διακόπτεται. Ένα πυκνό, στερεό ίζημα συγκεντρώνεται στον πυθμένα των δοκιμαστικών σωλήνων. Πάνω από αυτό βρίσκεται το υγρό μέρος της ουσίας.

Οι μηχανικές φυγόκεντρες κλειστού τύπου έχουν μεγάλο αριθμό χιτωνίων για την υποδοχή των δοκιμαστικών σωλήνων. Τέτοιες συσκευές είναι πιο βολικές σε σύγκριση με τις χειροκίνητες. Οι ρότορες τους κινούνται από ισχυρούς ηλεκτρικούς κινητήρες και μπορούν να επιταχύνουν έως τις 3000 σ.α.λ. Αυτό καθιστά δυνατό τον καλύτερο διαχωρισμό υγρών ουσιών από στερεές.

Χαρακτηριστικά προετοιμασίας σωλήνων για φυγοκέντρηση

Οι δοκιμαστικοί σωλήνες που χρησιμοποιούνται για φυγοκέντρηση πρέπει να γεμίζονται με το υλικό δοκιμής ίδιας μάζας. Επομένως, εδώ χρησιμοποιούνται ειδικές ζυγαριές υψηλής ακρίβειας για μετρήσεις. Όταν είναι απαραίτητο να εξισορροπηθούν πολλοί σωλήνες σε μια φυγόκεντρο, χρησιμοποιείται η ακόλουθη τεχνική. Αφού ζυγίσουμε μερικά γυάλινα δοχεία και πετύχουμε την ίδια μάζα, ένα από αυτά αφήνεται ως πρότυπο. Οι επόμενοι σωλήνες εξισορροπούνται με αυτό το δείγμα πριν τοποθετηθούν στη συσκευή. Αυτή η τεχνική επιταχύνει σημαντικά την εργασία όταν είναι απαραίτητο να προετοιμαστεί μια ολόκληρη σειρά σωλήνων για φυγοκέντρηση.

Αξίζει να σημειωθεί ότι υπερβολική ποσότητα της ελεγχόμενης ουσίας δεν τοποθετείται ποτέ σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Τα γυάλινα δοχεία γεμίζονται με τέτοιο τρόπο ώστε η απόσταση από την άκρη να είναι τουλάχιστον 10 mm. Διαφορετικά, η ουσία θα ρέει έξω από τον δοκιμαστικό σωλήνα υπό την επίδραση της φυγόκεντρης δύναμης.

Υπερφυγόκεντροι

Για να διαχωριστούν τα εξαρτήματα των εξαιρετικά λεπτών αναρτήσεων, δεν αρκεί η χρήση συμβατικών χειροκίνητων ή μηχανικών φυγοκεντρητών. Σε αυτή την περίπτωση, απαιτείται πιο εντυπωσιακή επίδραση σε ουσίες από φυγόκεντρες δυνάμεις. Κατά την εφαρμογή τέτοιων διαδικασιών, χρησιμοποιούνται υπερφυγόκεντροι.

Οι συσκευές του παρουσιαζόμενου σχεδίου είναι εξοπλισμένες με ένα τυφλό τύμπανο με τη μορφή σωλήνα μικρής διαμέτρου - όχι περισσότερο από 240 mm. Το μήκος ενός τέτοιου τυμπάνου υπερβαίνει σημαντικά τη διατομή του, γεγονός που καθιστά δυνατή τη σημαντική αύξηση του αριθμού των περιστροφών και τη δημιουργία μιας ισχυρής φυγόκεντρης δύναμης.

Σε μια υπερφυγόκεντρο, η ουσία που δοκιμάζεται εισέρχεται στο τύμπανο, κινείται μέσα από το σωλήνα και χτυπά ειδικούς ανακλαστήρες, οι οποίοι ρίχνουν το υλικό στα τοιχώματα της συσκευής. Υπάρχουν επίσης θάλαμοι σχεδιασμένοι για χωριστή αφαίρεση ελαφρών και βαρέων υγρών.

Τα πλεονεκτήματα των υπερφυγοκέντρων περιλαμβάνουν:

απόλυτη στεγανότητα?
η υψηλότερη ένταση διαχωρισμού ουσιών·
συμπαγείς διαστάσεις?
την ικανότητα διαχωρισμού ουσιών σε μοριακό επίπεδο.

Τελικά

Βρήκαμε λοιπόν τι είναι η φυγοκέντρηση. Επί του παρόντος, η μέθοδος βρίσκει την εφαρμογή της όταν είναι απαραίτητο να απομονωθούν ιζήματα από διαλύματα, να καθαριστούν υγρά και να διαχωριστούν συστατικά βιολογικά δραστικών και χημικών ουσιών. Οι υπερφυγόκεντροι χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό ουσιών σε μοριακό επίπεδο. Η μέθοδος φυγοκέντρησης χρησιμοποιείται ενεργά στη χημική βιομηχανία, το πετρέλαιο, την πυρηνική βιομηχανία, τη βιομηχανία τροφίμων, καθώς και στην ιατρική.

Εργασία μαθήματος

Φυγοκέντρηση

1. Αρχή της μεθόδου

Ο διαχωρισμός των ουσιών με τη χρήση φυγοκέντρησης βασίζεται στη διαφορετική συμπεριφορά των σωματιδίων σε ένα φυγόκεντρο πεδίο. Ένα εναιώρημα σωματιδίων τοποθετημένο σε δοκιμαστικό σωλήνα φορτώνεται σε έναν ρότορα που είναι τοποθετημένος στον κινητήριο άξονα της φυγόκεντρου.

Σε ένα φυγόκεντρο πεδίο, σωματίδια που έχουν διαφορετικές πυκνότητες, σχήματα ή μεγέθη καθιζάνουν με διαφορετικούς ρυθμούς. Ο ρυθμός καθίζησης εξαρτάται από τη φυγόκεντρη επιτάχυνση, η οποία είναι ευθέως ανάλογη με τη γωνιακή ταχύτητα του ρότορα και την απόσταση μεταξύ του σωματιδίου και του άξονα περιστροφής:

και η φυγόκεντρη επιτάχυνση θα είναι τότε ίση)

Αφού μια περιστροφή του ρότορα είναι 2π ακτίνια, η γωνιακή ταχύτητα του δρομέα σε στροφές ανά λεπτό μπορεί να γραφτεί ως εξής:

Η φυγόκεντρη επιτάχυνση εκφράζεται συνήθως σε μονάδες σολ και καλείται σχετική φυγόκεντρη επιτάχυνση, δηλ.

Κατά την απαρίθμηση των συνθηκών για τον διαχωρισμό σωματιδίων, αναφέρετε την ταχύτητα περιστροφής και την ακτίνα του ρότορα, καθώς και τον χρόνο φυγοκέντρησης. Η φυγόκεντρη επιτάχυνση εκφράζεται συνήθως σε μονάδες σολ, υπολογίζεται από τη μέση ακτίνα περιστροφής μιας στήλης υγρού σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης. Με βάση την εξίσωση, οι Dole και Κοτζιάς συνέταξαν ένα νομόγραμμα που εκφράζει την εξάρτηση του OCP από την ταχύτητα περιστροφής του δρομέα και την ακτίνα r.

Ο ρυθμός καθίζησης των σφαιρικών σωματιδίων εξαρτάται όχι μόνο από τη φυγόκεντρη επιτάχυνση, αλλά και από την πυκνότητα και την ακτίνα των ίδιων των σωματιδίων και από το ιξώδες του μέσου εναιώρησης. Ο χρόνος που απαιτείται για την καθίζηση ενός σφαιρικού σωματιδίου σε ένα υγρό μέσο από τον υγρό μηνίσκο μέχρι τον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης είναι αντιστρόφως ανάλογος του ρυθμού καθίζησης και προσδιορίζεται από την ακόλουθη εξίσωση:

όπου τ -- χρόνος καθίζησης σε δευτερόλεπτα, rj -- ιξώδες του μέσου, g h -- ακτίνα του σωματιδίου, r h -- πυκνότητα του σωματιδίου, p -- πυκνότητα του μέσου, g m -- απόσταση από τον άξονα περιστροφής στον μηνίσκος του υγρού, g d -- απόσταση από τον άξονα περιστροφής μέχρι τον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα.

Όπως προκύπτει από την εξίσωση, σε μια δεδομένη ταχύτητα ρότορα, ο χρόνος που απαιτείται για την καθίζηση ομοιογενών σφαιρικών σωματιδίων είναι αντιστρόφως ανάλογος με το τετράγωνο των ακτίνων τους και τη διαφορά στις πυκνότητες των σωματιδίων και του μέσου και είναι ευθέως ανάλογος με το ιξώδες του Μεσαίο. Επομένως, ένα μείγμα ετερογενών, περίπου σφαιρικών σωματιδίων, που διαφέρουν ως προς την πυκνότητα και το μέγεθος, μπορεί να διαχωριστεί είτε λόγω διαφορετικών χρόνων απόθεσης στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα με δεδομένη επιτάχυνση είτε λόγω της κατανομής των σωματιδίων καθίζησης κατά μήκος του δοκιμαστικός σωλήνας, εγκατεστημένος μετά από ορισμένο χρονικό διάστημα. Κατά τον διαχωρισμό ουσιών, είναι απαραίτητο να ληφθούν υπόψη σημαντικοί παράγοντες όπως η πυκνότητα και το ιξώδες του μέσου. Χρησιμοποιώντας τις περιγραφόμενες μεθόδους, είναι δυνατός ο διαχωρισμός κυτταρικών οργανιδίων από ομογενοποιήματα ιστού. Τα κύρια συστατικά του κυττάρου εναποτίθενται με την ακόλουθη σειρά: πρώτα, ολόκληρα κύτταρα και τα θραύσματά τους, μετά πυρήνες, χλωροπλάστες, μιτοχόνδρια, λυσοσώματα, μικροσώματα και τέλος ριβοσώματα. Η καθίζηση των μη σφαιρικών σωματιδίων δεν ακολουθεί μια εξίσωση, έτσι σωματίδια ίδιας μάζας αλλά διαφορετικού σχήματος καθιζάνουν με διαφορετικές ταχύτητες. Αυτό το χαρακτηριστικό χρησιμοποιείται κατά τη μελέτη της διαμόρφωσης μακρομορίων με χρήση υπερφυγοκέντρησης.

αποτελείται από απομόνωση βιολογικού υλικού για μεταγενέστερες βιοχημικές μελέτες. Σε αυτή την περίπτωση, είναι δυνατό να ληφθούν μεγάλες ποσότητες αρχικού βιολογικού υλικού, για παράδειγμα, σπορά μικροβιακών κυττάρων από καλλιέργειες παρτίδας ή συνεχείς, καθώς και σπορά φυτικών και ζωικών κυττάρων από καλλιέργειες ιστών και πλάσμα αίματος. Χρησιμοποιώντας προπαρασκευαστική φυγοκέντρηση, μεγάλοι αριθμοί κυτταρικών σωματιδίων απομονώνονται για να μελετηθεί η μορφολογία, η δομή και η βιολογική τους δραστηριότητα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται επίσης για την απομόνωση βιολογικών μακρομορίων όπως το DNA και τις πρωτεΐνες από προκαθαρισμένα παρασκευάσματα.

Αναλυτική φυγοκέντρηση χρησιμοποιείται κυρίως για τη μελέτη καθαρών ή ουσιαστικά καθαρών παρασκευασμάτων μακρομορίων ή σωματιδίων, όπως τα ριβοσώματα. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται μικρή ποσότητα υλικού και η καθίζηση των υπό μελέτη σωματιδίων καταγράφεται συνεχώς με τη χρήση ειδικών οπτικών συστημάτων. Η μέθοδος σάς επιτρέπει να λαμβάνετε δεδομένα σχετικά με την καθαρότητα, το μοριακό βάρος και τη δομή του υλικού. Σε εργαστήρια για μαθητές, η προπαρασκευαστική φυγοκέντρηση χρησιμοποιείται πολύ πιο συχνά από την αναλυτική φυγοκέντρηση, επομένως θα σταθούμε σε αυτήν με περισσότερες λεπτομέρειες, αν και και οι δύο μέθοδοι βασίζονται σε γενικές αρχές.

2. Προπαρασκευαστική φυγοκέντρηση

2.1 Διαφορική φυγοκέντρηση

Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε διαφορές στους ρυθμούς καθίζησης των σωματιδίων που διαφέρουν σε μέγεθος και πυκνότητα. Το προς διαχωρισμό υλικό, για παράδειγμα ομογενοποίηση ιστού, φυγοκεντρείται με σταδιακή αύξηση της φυγοκεντρικής επιτάχυνσης, η οποία επιλέγεται έτσι ώστε σε κάθε στάδιο ένα συγκεκριμένο κλάσμα να εναποτίθεται στον πυθμένα του σωλήνα. Στο τέλος κάθε σταδίου, το ίζημα διαχωρίζεται από το υπερκείμενο και πλένεται αρκετές φορές για να ληφθεί τελικά ένα καθαρό κλάσμα ιζήματος. Δυστυχώς, είναι σχεδόν αδύνατο να ληφθεί ένα απολύτως καθαρό ίζημα. Για να καταλάβουμε γιατί συμβαίνει αυτό, ας δούμε τη διαδικασία που συμβαίνει σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης στην αρχή κάθε σταδίου φυγοκέντρησης.

Αρχικά, όλα τα σωματίδια του ομογενοποιήματος κατανέμονται ομοιόμορφα σε όλο τον όγκο του σωλήνα φυγοκέντρησης, επομένως είναι αδύνατο να ληφθούν καθαρά παρασκευάσματα ιζημάτων των βαρύτερων σωματιδίων σε έναν κύκλο φυγοκέντρησης: το πρώτο ίζημα που σχηματίζεται περιέχει κυρίως τα βαρύτερα σωματίδια, αλλά Επιπλέον, επίσης μια ορισμένη ποσότητα όλων των αρχικών εξαρτημάτων. Ένα επαρκώς καθαρό παρασκεύασμα βαρέων σωματιδίων μπορεί να ληφθεί μόνο με εκ νέου εναιώρηση και φυγοκέντρηση του αρχικού ιζήματος. Περαιτέρω φυγοκέντρηση του υπερκειμένου με επακόλουθη αύξηση της φυγόκεντρης επιτάχυνσης οδηγεί σε καθίζηση σωματιδίων μεσαίου μεγέθους και πυκνότητας και στη συνέχεια σε καθίζηση των μικρότερων σωματιδίων που έχουν τη χαμηλότερη πυκνότητα. Στο Σχ. Το σχήμα 2.3 δείχνει ένα διάγραμμα της κλασματοποίησης του ομογενοποιήματος ήπατος αρουραίου.

Η διαφορική φυγοκέντρηση είναι ίσως η πιο κοινή μέθοδος για την απομόνωση κυτταρικών οργανιδίων από ομογενοποιήματα ιστού. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται με μεγαλύτερη επιτυχία για τον διαχωρισμό κυτταρικών οργανιδίων που διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σε μέγεθος και πυκνότητα. Αλλά ακόμη και σε αυτή την περίπτωση, τα κλάσματα που προκύπτουν δεν είναι ποτέ απολύτως ομοιογενή και άλλες μέθοδοι που περιγράφονται παρακάτω χρησιμοποιούνται για τον περαιτέρω διαχωρισμό τους. Αυτές οι μέθοδοι, βασισμένες στις διαφορές στην πυκνότητα των οργανιδίων, παρέχουν πιο αποτελεσματικούς διαχωρισμούς εκτελώντας φυγοκέντρηση σε διαλύματα με συνεχή ή σταδιακή βαθμίδα πυκνότητας. Το μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι χρειάζεται χρόνος για να ληφθεί μια κλίση πυκνότητας διαλύματος.

2.2 Φυγοκέντρηση ζώνης-ταχύτητας

Η μέθοδος ταχύτητας-ζωνικής, ή, όπως αποκαλείται επίσης, φυγοκέντρηση s-ζωνικής, συνίσταται στη στρώση του δείγματος δοκιμής στην επιφάνεια ενός διαλύματος με συνεχή κλίση πυκνότητας. Το δείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρείται έως ότου τα σωματίδια κατανεμηθούν κατά μήκος της βαθμίδωσης σε διακριτές ζώνες ή ζώνες. Δημιουργώντας μια κλίση πυκνότητας, αποφεύγεται η ανάμειξη των ζωνών που προκύπτουν από τη μεταφορά. Η μέθοδος φυγοκέντρησης ζώνης ταχύτητας χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό υβριδίων RNA-DNA, ριβοσωμικών υπομονάδων και άλλων κυτταρικών συστατικών.

2.3 Ισοπυκνική φυγοκέντρηση

Η ισοπυκνική φυγοκέντρηση πραγματοποιείται τόσο με βαθμίδα πυκνότητας όσο και με τον συνήθη τρόπο. Εάν η φυγοκέντρηση δεν διεξάγεται σε βαθμίδα πυκνότητας, το παρασκεύασμα φυγοκεντρείται πρώτα έτσι ώστε τα σωματίδια των οποίων το μοριακό βάρος είναι μεγαλύτερο από αυτό των σωματιδίων που μελετώνται να καθιζάνουν. Αυτά τα βαριά σωματίδια απορρίπτονται και το δείγμα εναιωρείται σε ένα μέσο του οποίου η πυκνότητα είναι ίδια με εκείνη του κλάσματος που πρόκειται να απομονωθεί, και στη συνέχεια φυγοκεντρούνται έως ότου τα σωματίδια ενδιαφέροντος καθιζάνουν στον πυθμένα του σωλήνα και τα σωματίδια χαμηλότερης πυκνότητας επιπλέουν στο επιφάνεια του υγρού..

Μια άλλη μέθοδος είναι η στρώση του δείγματος στην επιφάνεια του διαλύματος με συνεχή κλίση πυκνότητας που καλύπτει το εύρος των πυκνοτήτων όλων των συστατικών του μείγματος. Η φυγοκέντρηση εκτελείται έως ότου η πυκνότητα άνωσης των σωματιδίων είναι ίση με την πυκνότητα των αντίστοιχων ζωνών, δηλαδή μέχρι να διαχωριστούν τα σωματίδια σε ζώνες. Η μέθοδος ονομάζεται ζώνη-ισοπυκνική ή συντονισμένη φυγοκέντρηση, καθώς το κύριο σημείο εδώ είναι η πυκνότητα άνωσης και όχι το μέγεθος ή το σχήμα των σωματιδίων. Η πυκνότητα στην οποία τα σωματίδια σχηματίζουν ισοπυκνικές ζώνες επηρεάζεται από τη φύση του μέσου εναιώρησης. Τα σωματίδια μπορεί να είναι διαπερατά σε ορισμένες ενώσεις του διαλύματος και αδιαπέραστα σε άλλες, ή μπορούν να προσκολλήσουν μόρια του διαλύματος. Όταν χρησιμοποιείται ένας ζωνικός ρότορας, τα μιτοχόνδρια, τα λυσοσώματα, τα υπεροξισώματα και τα μικροσώματα συγκεντρώνονται σε ζώνες με 42%, 47%, 47% και 27% σακχαρόζη, που αντιστοιχούν σε πυκνότητες 1,18, 1,21, 1,21 και 1,10 g-cm -3 αντίστοιχα. Η πυκνότητα των υποκυτταρικών οργανιδίων εξαρτάται επίσης από την επιλεκτική απορρόφηση ορισμένων ενώσεων. Η χορήγηση του απορρυπαντικού Triton WR-1339, το οποίο δεν προκαλεί αιμόλυση, σε αρουραίους οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους και μείωση της πυκνότητας των ηπατικών λυσοσωμάτων. η πυκνότητα των μιτοχονδρίων και των υπεροξισωμάτων παραμένει αμετάβλητη. Παρά το γεγονός ότι οι ιδιότητες καθίζησης των λυσοσωμάτων, κατά κανόνα, δεν αλλάζουν, η πυκνότητα ισορροπίας τους στη βαθμίδα σακχαρόζης μειώνεται από 1,21 σε 1,1, γεγονός που οδηγεί σε αντίστοιχο διαχωρισμό του λυσοσωμικού-υπεροξισωμικού κλάσματος. Αυτό το χαρακτηριστικό χρησιμοποιείται στον ποσοτικό διαχωρισμό λυσοσωμάτων, μιτοχονδρίων και υπεροξισωμάτων, με βάση την αφαίρεση από ένα ομοιογενές μέσο όλων των σωματιδίων με πυκνότητα μεγαλύτερη από αυτή των μικροσωμάτων και την επακόλουθη ισοπυκνική φυγοκέντρηση των καταβυθισμένων βαρέων σωματιδίων.

2.4 Φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας ισορροπίας

Για τη δημιουργία μιας βαθμίδας πυκνότητας, χρησιμοποιούνται άλατα βαρέων μετάλλων, όπως το ρουβίδιο ή το καίσιο, καθώς και διαλύματα σακχαρόζης. Το δείγμα, όπως το DNA, αναμιγνύεται με ένα συμπυκνωμένο διάλυμα χλωριούχου καισίου. Τόσο η διαλυμένη ουσία όσο και ο διαλύτης κατανέμονται αρχικά ομοιόμορφα σε όλο τον όγκο. Κατά τη φυγοκέντρηση, δημιουργείται μια κατανομή ισορροπίας της συγκέντρωσης και, κατά συνέπεια, της πυκνότητας του CsCl, καθώς τα ιόντα καισίου έχουν μεγάλη μάζα. Υπό την επίδραση της φυγόκεντρης επιτάχυνσης, τα μόρια DNA ανακατανέμονται, συλλέγοντας με τη μορφή ξεχωριστής ζώνης σε ένα τμήμα του δοκιμαστικού σωλήνα με αντίστοιχη πυκνότητα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται κυρίως στην αναλυτική φυγοκέντρηση και χρησιμοποιήθηκε από τους Meselson και Stahl για τη μελέτη του μηχανισμού αντιγραφής του DNA ΜΙ. coli . Η φυγοκέντρηση βαθμιαίας πυκνότητας ισορροπίας είναι επίσης μία από τις μεθόδους διαχωρισμού και μελέτης λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα του ανθρώπινου αίματος.

2.5 Δημιουργία και εξαγωγή κλίσεων

2.5.1 Φύση των κλίσεων

Για τη δημιουργία διαβαθμίσεων πυκνότητας στα διαλύματα, τα διαλύματα σακχαρόζης χρησιμοποιούνται συχνότερα, μερικές φορές με σταθερό pH. Σε ορισμένες περιπτώσεις, επιτυγχάνεται καλός διαχωρισμός όταν χρησιμοποιείται D 2 0 αντί για συνηθισμένο νερό. Στον πίνακα. Ο Πίνακας 2.1 δείχνει τις ιδιότητες ορισμένων διαλυμάτων σακχαρόζης.

Η επιλογή της κλίσης υπαγορεύεται από συγκεκριμένους στόχους κλασματοποίησης. Για παράδειγμα, το Ficol, που παράγεται από την Pharmacia Fine Chemicals, μπορεί να αντικαταστήσει τη σακχαρόζη σε περιπτώσεις όπου είναι απαραίτητο να δημιουργηθούν βαθμίδες με υψηλή πυκνότητα και χαμηλή οσμωτική πίεση. Ένα άλλο πλεονέκτημα του Ficol είναι ότι δεν περνά από τις κυτταρικές μεμβράνες. Για τη δημιουργία κλίσεων υψηλότερης πυκνότητας, χρησιμοποιούνται άλατα βαρέων μετάλλων, όπως το ρουβίδιο και το καίσιο, ωστόσο, λόγω της διαβρωτικής επίδρασης του CsCl, τέτοιες βαθμίδες χρησιμοποιούνται μόνο σε ρότορες κατασκευασμένους από ανθεκτικά μέταλλα, όπως το τιτάνιο».

2.5.2 Μέθοδος δημιουργίας βαθμίδας πυκνότητας βήματος

Για να δημιουργηθεί μια κλίση πυκνότητας, διάφορα διαλύματα με διαδοχικά φθίνουσα πυκνότητα μεταφέρονται προσεκτικά με πιπέτα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης. Στη συνέχεια, το δείγμα τοποθετείται στο ανώτερο στρώμα, το οποίο έχει τη χαμηλότερη πυκνότητα, με τη μορφή στενής ζώνης, μετά την οποία ο σωλήνας φυγοκεντρείται. Ομαλές γραμμικές διαβαθμίσεις μπορούν να ληφθούν εξομαλύνοντας τις κλίσεις βημάτων όταν το διάλυμα παραμένει για μεγάλο χρονικό διάστημα. Η διαδικασία μπορεί να επιταχυνθεί αναδεύοντας απαλά το περιεχόμενο του σωλήνα με ένα σύρμα ή ανακινώντας απαλά το σωλήνα.

2.5.3 Μέθοδος δημιουργίας ομαλής κλίσης πυκνότητας

Στις περισσότερες περιπτώσεις, χρησιμοποιείται μια ειδική συσκευή για τη δημιουργία μιας ομαλής κλίσης πυκνότητας. Αποτελείται από δύο κυλινδρικά δοχεία αυστηρά καθορισμένης ίδιας διαμέτρου, που επικοινωνούν μεταξύ τους στο κάτω μέρος χρησιμοποιώντας έναν γυάλινο σωλήνα με βαλβίδα ελέγχου, που σας επιτρέπει να ρυθμίσετε τις αναλογίες στις οποίες αναμειγνύονται τα περιεχόμενα και των δύο δοχείων. Ένα από αυτά είναι εξοπλισμένο με αναδευτήρα και έχει μια έξοδο μέσω της οποίας το διάλυμα ρέει σε σωλήνες φυγοκέντρησης. Το πυκνότερο διάλυμα τοποθετείται στο μίξερ. ο δεύτερος κύλινδρος είναι γεμάτος με διάλυμα μικρότερης πυκνότητας. Το ύψος της στήλης διαλύματος και στους δύο κυλίνδρους ρυθμίζεται έτσι ώστε η υδροστατική πίεση σε αυτούς να είναι η ίδια. Το πυκνότερο διάλυμα απελευθερώνεται σταδιακά από τον αναμικτήρα σε σωλήνες φυγοκέντρησης και αντικαθίσταται ταυτόχρονα από ίσο όγκο διαλύματος χαμηλότερης πυκνότητας που εισέρχεται στον αναμικτήρα από τον δεύτερο κύλινδρο μέσω της βαλβίδας ελέγχου. Η ομοιογένεια του διαλύματος στο μίξερ εξασφαλίζεται με συνεχή ανάδευση του διαλύματος με χρήση αναδευτήρα. Καθώς το διάλυμα χύνεται σε σωλήνες φυγοκέντρησης, η πυκνότητά του μειώνεται και δημιουργείται μια γραμμική κλίση πυκνότητας στους σωλήνες. Οι μη γραμμικές κλίσεις μπορούν να δημιουργηθούν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα που αποτελείται από δύο κυλίνδρους άνισης διαμέτρου.

Για να σχηματιστούν βαθμίδες πυκνότητας ποικίλης απότομης κλίσης, χρησιμοποιείται ένα σύστημα δύο μηχανικά ελεγχόμενων σύριγγων, οι οποίες είναι γεμάτες με διαλύματα άνισης πυκνότητας. Διαφορετικές κλίσεις μπορούν να δημιουργηθούν αλλάζοντας τη σχετική ταχύτητα των εμβόλων.

2.5.4 Αφαίρεση κλίσεων από σωλήνες φυγοκέντρησης

Αφού ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση και ο διαχωρισμός των σωματιδίων, οι ζώνες που προκύπτουν πρέπει να αφαιρεθούν. Αυτό γίνεται με διάφορους τρόπους, τις περισσότερες φορές με μετατόπιση. Ο σωλήνας φυγοκέντρησης τρυπιέται στη βάση και ένα πολύ πυκνό μέσο, για παράδειγμα ένα διάλυμα σακχαρόζης 60-70%, εισάγεται αργά στο κάτω μέρος του. Το διάλυμα στην κορυφή μετατοπίζεται και τα κλάσματα συλλέγονται χρησιμοποιώντας μια σύριγγα, μια πιπέτα ή μια ειδική συσκευή που συνδέεται μέσω ενός σωλήνα στον συλλέκτη κλασμάτων. Εάν οι σωλήνες είναι κατασκευασμένοι από κυτταρίνη ή νιτροκυτταρίνη, τα κλάσματα αφαιρούνται κόβοντας το σωλήνα με ειδική λεπίδα. Για να γίνει αυτό, ένας σωλήνας φυγοκέντρησης στερεωμένος σε βάση κόβεται απευθείας κάτω από την επιθυμητή περιοχή και το κλάσμα αναρροφάται με μια σύριγγα ή μια πιπέτα. Με κατάλληλο σχεδιασμό συσκευής κοπής, η απώλεια διαλύματος θα είναι ελάχιστη. Τα κλάσματα συλλέγονται επίσης τρυπώντας τη βάση του σωλήνα με μια λεπτή κοίλη βελόνα. Τα σταγονίδια που ρέουν από το σωλήνα μέσω της βελόνας συλλέγονται σε συλλέκτη κλασμάτων για περαιτέρω ανάλυση.

2.5.5 Προπαρασκευαστικές φυγόκεντρες και εφαρμογές τους

Οι προπαρασκευαστικές φυγόκεντρες μπορούν να χωριστούν σε τρεις κύριες ομάδες: φυγόκεντρες γενικής χρήσης, φυγόκεντρες υψηλής ταχύτητας και προπαρασκευαστικές υπερφυγόκεντρες. Φυγόκεντροι γενικής χρήσης δώστε μέγιστη ταχύτητα 6000 rpm * min -1 και συνολική ταχύτητα έως 6000 σολ . Διαφέρουν μεταξύ τους μόνο ως προς την χωρητικότητα και έχουν έναν αριθμό αντικαταστάσιμων ρότορων: γωνιακοί και με κρεμαστά κύπελλα. Ένα από τα χαρακτηριστικά αυτού του τύπου φυγόκεντρου είναι η μεγάλη χωρητικότητά τους - από 4 έως 6 dm 3 , που τους επιτρέπει να φορτώνονται όχι μόνο με σωλήνες φυγοκέντρησης 10,50 και 100 cm 3, αλλά και με δοχεία χωρητικότητας έως 1,25 dm 3. Σε όλες τις φυγόκεντρες αυτού του τύπου, οι ρότορες είναι στερεωμένοι άκαμπτα στον άξονα μετάδοσης κίνησης και οι σωλήνες φυγοκέντρησης, μαζί με το περιεχόμενό τους, πρέπει να είναι προσεκτικά ισορροπημένοι και να διαφέρουν σε βάρος όχι περισσότερο από 0,25 g. Ο περιττός αριθμός σωλήνων δεν πρέπει να είναι φορτώνεται στον ρότορα και εάν ο ρότορας δεν είναι πλήρως φορτισμένος, οι σωλήνες πρέπει να τοποθετούνται συμμετρικά, ο ένας απέναντι στον άλλο, διασφαλίζοντας έτσι μια ομοιόμορφη κατανομή των σωλήνων σε σχέση με τον άξονα περιστροφής του ρότορα.

Φυγόκεντροι υψηλής ταχύτητας δίνουν μέγιστη ταχύτητα 25.000 rpm -1 και συνολική ταχύτητα έως 89.000 g. Ο θάλαμος του ρότορα είναι εξοπλισμένος με ένα σύστημα ψύξης που αποτρέπει τη θερμότητα που προκύπτει λόγω τριβής όταν ο ρότορας περιστρέφεται. Κατά κανόνα, οι φυγόκεντροι υψηλής ταχύτητας έχουν χωρητικότητα 1,5 dm 3 και είναι εξοπλισμένοι με αντικαταστάσιμους ρότορες, τόσο γωνιακούς όσο και με κρεμαστά κύπελλα.

Προπαρασκευαστικές υπερφυγόκεντρες δίνουν μέγιστη ταχύτητα έως και 75.000 rpm -1 και μέγιστη φυγόκεντρη επιτάχυνση 510.000 σολ . Είναι εξοπλισμένα τόσο με ψυγείο όσο και με μονάδα κενού για την αποφυγή υπερθέρμανσης του ρότορα λόγω τριβής με τον αέρα. Οι ρότορες τέτοιων φυγοκεντρητών είναι κατασκευασμένοι από υψηλής αντοχής κράματα αλουμινίου ή τιτανίου. Χρησιμοποιούνται κυρίως ρότορες από κράματα αλουμινίου, αλλά σε περιπτώσεις που απαιτούνται ιδιαίτερα υψηλές ταχύτητες, χρησιμοποιούνται ρότορες από τιτάνιο. Για τη μείωση των κραδασμών που προκύπτουν από την ανισορροπία του ρότορα λόγω της ανομοιόμορφης πλήρωσης των σωλήνων φυγοκέντρησης, οι υπερφυγόκεντροι έχουν έναν εύκαμπτο άξονα. Οι σωλήνες φυγοκέντρησης και το περιεχόμενό τους πρέπει να ζυγοσταθμίζονται προσεκτικά με ακρίβεια 0,1 g. Παρόμοιες απαιτήσεις πρέπει να τηρούνται κατά τη φόρτωση των ρότορων των φυγοκεντρητών γενικής χρήσης.

2.6 Σχεδιασμός ρότορα

2.6.1 Γωνιακοί ρότορες και ρότορες με αναρτημένα μπολ

Οι προπαρασκευαστικοί ρότορες φυγοκέντρου είναι συνήθως δύο τύπων - γωνιακοί και με κρεμαστές λεκάνες. Ονομάζονται γωνιακοί επειδή οι φυγοκεντρικοί σωλήνες που τοποθετούνται σε αυτούς βρίσκονται πάντα σε μια ορισμένη γωνία ως προς τον άξονα περιστροφής. Σε ρότορες με κρεμαστά ποτήρια ζέσεως, οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται κατακόρυφα και όταν περιστρέφονται υπό την επίδραση της προκύπτουσας φυγόκεντρης δύναμης, μετακινούνται σε οριζόντια θέση. η γωνία κλίσης ως προς τον άξονα περιστροφής είναι 90°.

Στους ρότορες ορθής γωνίας, η απόσταση που διανύουν τα σωματίδια στο αντίστοιχο τοίχωμα του δοκιμαστικού σωλήνα είναι πολύ μικρή και επομένως η καθίζηση συμβαίνει σχετικά γρήγορα. Μετά τη σύγκρουση με τα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα, τα σωματίδια γλιστρούν προς τα κάτω και σχηματίζουν ένα ίζημα στο κάτω μέρος. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, προκύπτουν ρεύματα μεταφοράς, τα οποία περιπλέκουν πολύ τον διαχωρισμό σωματιδίων με παρόμοιες ιδιότητες καθίζησης. Ωστόσο, ρότορες παρόμοιου σχεδιασμού χρησιμοποιούνται με επιτυχία για τον διαχωρισμό σωματιδίων των οποίων οι ρυθμοί καθίζησης ποικίλλουν αρκετά σημαντικά.

Σε ρότορες με αιωρούμενα κύπελλα, παρατηρούνται επίσης φαινόμενα μεταφοράς, αλλά δεν είναι τόσο έντονα. Η μεταφορά είναι το αποτέλεσμα του γεγονότος ότι, υπό την επίδραση της φυγόκεντρης επιτάχυνσης, τα σωματίδια καθιζάνουν σε διεύθυνση όχι αυστηρά κάθετη προς τον άξονα περιστροφής και επομένως, όπως στους γωνιακούς ρότορες, προσκρούουν στα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα και ολισθαίνουν προς το κάτω μέρος.

Τα φαινόμενα μεταφοράς και στροβιλισμού μπορούν να αποφευχθούν σε κάποιο βαθμό χρησιμοποιώντας τομεακούς σωλήνες σε κρεμαστές ρότορες μπολ και ρυθμίζοντας την ταχύτητα του ρότορα. Η μέθοδος φυγοκέντρησης με κλίση πυκνότητας στερείται επίσης τα μειονεκτήματα που αναφέρονται παραπάνω.

2.6.2 Συνεχείς ρότορες

Οι συνεχείς ρότορες έχουν σχεδιαστεί για κλασμάτωση υψηλής ταχύτητας σχετικά μικρών ποσοτήτων στερεού υλικού από εναιωρήματα μεγάλου όγκου, για παράδειγμα για απομόνωση κυττάρων από μέσα καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, ένα εναιώρημα σωματιδίων προστίθεται συνεχώς στον ρότορα. Η απόδοση του ρότορα εξαρτάται από τη φύση του εναποτιθέμενου φαρμάκου και ποικίλλει από 100 cm 3 έως 1 dm 3 ανά λεπτό. Η ιδιαιτερότητα του ρότορα είναι ότι είναι ένας μονωμένος θάλαμος ειδικού σχεδιασμού. το περιεχόμενό του δεν επικοινωνεί με το εξωτερικό περιβάλλον και επομένως δεν μολύνεται ή διασκορπίζεται.

2.6.3 Ρότορες ζώνης ή ρότορες Anderson

Οι ζωνικοί ρότορες είναι κατασκευασμένοι από κράματα αλουμινίου ή τιτανίου, τα οποία είναι ικανά να αντέχουν πολύ σημαντικές φυγόκεντρες επιταχύνσεις. Συνήθως έχουν μια κυλινδρική κοιλότητα που κλείνει με αφαιρούμενο καπάκι. Μέσα στην κοιλότητα, στον άξονα περιστροφής, υπάρχει ένας αξονικός σωλήνας πάνω στον οποίο τοποθετείται ένα ακροφύσιο με λεπίδες, χωρίζοντας την κοιλότητα του ρότορα σε τέσσερις τομείς. Τα πτερύγια ή τα διαφράγματα έχουν ακτινικά κανάλια μέσω των οποίων ωθείται μια κλίση από τον αξονικό σωλήνα προς την περιφέρεια του ρότορα. Χάρη σε αυτόν τον σχεδιασμό των λεπίδων, η μεταφορά μειώνεται στο ελάχιστο.

Ο ρότορας γεμίζει όταν περιστρέφεται με ταχύτητα περίπου 3000 rpm - 1. Μια προ-δημιουργημένη κλίση αντλείται στον ρότορα, ξεκινώντας από ένα στρώμα της χαμηλότερης πυκνότητας, το οποίο κατανέμεται ομοιόμορφα κατά μήκος της περιφέρειας του ρότορα και συγκρατείται στο εξωτερικό του τοίχωμα κάθετο στον άξονα περιστροφής λόγω φυγόκεντρης δύναμης . Καθώς στη συνέχεια προστίθενται στρώματα κλίσης υψηλότερης πυκνότητας, υπάρχει μια συνεχής μετατόπιση προς το κέντρο των λιγότερο πυκνών στρωμάτων. Αφού αντληθεί ολόκληρη η κλίση στον ρότορα, γεμίζεται σε πλήρη όγκο με ένα διάλυμα που ονομάζεται «μαξιλάρι», η πυκνότητα του οποίου ταιριάζει ή υπερβαίνει ελαφρώς την υψηλότερη πυκνότητα της προσχηματισμένης κλίσης.

Στη συνέχεια, μέσω του αξονικού σωλήνα, το δείγμα δοκιμής τοποθετείται σε στρώματα , το οποίο εξαναγκάζεται να βγει από το σωλήνα στον όγκο του ρότορα χρησιμοποιώντας διάλυμα χαμηλότερης πυκνότητας, ενώ ο ίδιος όγκος του «μαξιλαριού» αφαιρείται από την περιφέρεια. Μετά από όλες αυτές τις διαδικασίες, η ταχύτητα περιστροφής του ρότορα φέρεται στην ταχύτητα λειτουργίας και πραγματοποιείται είτε ζώνη-ταχύτητα είτε ζώνη-ισοπυκνική κλασμάτωση για την απαιτούμενη χρονική περίοδο. . Η εξαγωγή των κλασμάτων πραγματοποιείται με ταχύτητα δρομέα 3000 rpm -1. Τα περιεχόμενα του ρότορα μετατοπίζονται προσθέτοντας ένα «μαξιλάρι» από την περιφέρεια· πρώτα μετατοπίζονται λιγότερο πυκνά στρώματα . Χάρη στον ειδικό σχεδιασμό του αξονικού καναλιού του ρότορα Anderson, δεν πραγματοποιείται ανάμειξη ζωνών όταν μετατοπίζονται. Η βαθμίδα εξόδου διέρχεται μέσω μιας συσκευής καταγραφής, για παράδειγμα του κυττάρου ενός φασματοφωτόμετρου, με το οποίο η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μπορεί να προσδιοριστεί με απορρόφηση στα 280 nm, ή μέσω ενός ειδικού ανιχνευτή ραδιενέργειας, μετά τον οποίο συλλέγονται τα κλάσματα.

Η χωρητικότητα των ζωνικών ρότορων που χρησιμοποιούνται σε μεσαίες ταχύτητες κυμαίνεται από 650 έως 1600 cm 3, γεγονός που καθιστά δυνατή την απόκτηση αρκετά μεγάλης ποσότητας υλικού. Οι ρότορες ζώνης χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση ακαθαρσιών πρωτεϊνών από διάφορα παρασκευάσματα και για την απομόνωση και τον καθαρισμό μιτοχονδρίων, λυσοσωμάτων, πολυσωμάτων και πρωτεϊνών.

2.6.4 Ανάλυση υποκυτταρικών κλασμάτων

Οι ιδιότητες των υποκυτταρικών σωματιδίων που λαμβάνονται κατά την κλασμάτωση του φαρμάκου μπορούν να αποδοθούν στις ιδιότητες των ίδιων των σωματιδίων μόνο εάν το φάρμακο δεν περιέχει ακαθαρσίες. Επομένως, είναι πάντα απαραίτητο να αξιολογείται η καθαρότητα των παρασκευασμάτων που προκύπτουν. Η αποτελεσματικότητα της ομογενοποίησης και η παρουσία ακαθαρσιών στο παρασκεύασμα μπορούν να προσδιοριστούν χρησιμοποιώντας μικροσκοπική εξέταση. Ωστόσο, η απουσία ορατών ακαθαρσιών δεν είναι ακόμη αξιόπιστη απόδειξη της καθαρότητας του φαρμάκου. Για να ποσοτικοποιηθεί η καθαρότητα, το παρασκεύασμα που προκύπτει υποβάλλεται σε χημική ανάλυση, η οποία καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό της περιεκτικότητάς του σε πρωτεΐνη ή DNA, την ενζυματική του δράση, εάν είναι δυνατόν, και τις ανοσολογικές του ιδιότητες.

Η ανάλυση της κατανομής των ενζύμων σε κλασματοποιημένους ιστούς βασίζεται σε δύο γενικές αρχές. Το πρώτο από αυτά είναι ότι όλα τα σωματίδια ενός δεδομένου υποκυτταρικού πληθυσμού περιέχουν το ίδιο σύνολο ενζύμων. Το δεύτερο υποθέτει ότι κάθε ένζυμο βρίσκεται σε μια συγκεκριμένη θέση μέσα στο κύτταρο. Εάν αυτή η θέση ήταν αληθής, τότε τα ένζυμα θα μπορούσαν να δράσουν ως δείκτες για τα αντίστοιχα οργανίδια: για παράδειγμα, η οξειδάση του κυτοχρώματος και η μονοαμινοξειδάση θα χρησίμευαν ως ένζυμα δείκτης για τα μιτοχόνδρια, οι όξινες υδρολάσες ως δείκτες για τα λυσοσώματα, η καταλάση ως δείκτης για τα υπεροξισώματα και η γλυκόζη- Η 6-φωσφατάση είναι δείκτης μικροσωμικών μεμβρανών. Αποδείχθηκε, ωστόσο, ότι ορισμένα ένζυμα, όπως η μηλική αφυδρογονάση, R-Η γλυκουρονιδάση, η NADP H-κυτοχρωματική αναγωγάση, εντοπίζονται σε περισσότερα από ένα κλάσματα. Επομένως, η επιλογή των ενζύμων δεικτών για τα υποκυτταρικά κλάσματα σε κάθε συγκεκριμένη περίπτωση πρέπει να προσεγγίζεται με μεγάλη προσοχή. Επιπλέον, η απουσία ενζύμου δείκτη δεν σημαίνει η απουσία αντίστοιχων οργανιδίων Είναι πιθανό ότι κατά τη διάρκεια της κλασμάτωσης το ένζυμο χάνεται από τα οργανίδια ή αναστέλλεται ή αδρανοποιείται, επομένως τουλάχιστον δύο ενζυμικοί δείκτες προσδιορίζονται συνήθως για κάθε κλάσμα.

Κλάσμα	Όγκος, cm"	Γενική αναπαραγωγή	Εξάλειψη, 660 nm	Μονάδες ενζυμικής δραστηριότητας	Απόδοση δραστηριότητας σε κλάσματα, %

2.7 Κλασματοποίηση με διαφορική φυγοκέντρηση

2.7.1 Παρουσίαση αποτελεσμάτων

Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από την κλασμάτωση ιστού παρουσιάζονται πιο εύκολα με τη μορφή γραφημάτων. Έτσι, κατά τη μελέτη της κατανομής των ενζύμων στους ιστούς, τα δεδομένα παρουσιάζονται καλύτερα με τη μορφή ιστογραμμάτων, τα οποία καθιστούν δυνατή την οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των πειραμάτων.

Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ενζυματικής δραστηριότητας στο δείγμα προσδιορίζεται τόσο στο αρχικό ομογενοποίημα όσο και σε κάθε απομονωμένο υποκυτταρικό κλάσμα χωριστά. Η συνολική ενζυματική δραστηριότητα και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στα κλάσματα δεν πρέπει να διαφέρουν πολύ από τις αντίστοιχες τιμές στο αρχικό ομογενοποίημα.

Στη συνέχεια, η ενζυματική δραστηριότητα και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε κάθε κλάσμα υπολογίζονται ως ποσοστό της συνολικής απόδοσης, με βάση την οποία συντάσσεται ένα ιστόγραμμα. Η σχετική ποσότητα πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα με τη σειρά της απομόνωσής τους απεικονίζεται διαδοχικά κατά μήκος του άξονα της τετμημένης και η σχετική ειδική δραστηριότητα κάθε κλάσματος απεικονίζεται κατά μήκος του άξονα τεταγμένων. Έτσι, η ενζυματική δραστηριότητα κάθε κλάσματος καθορίζεται από την περιοχή των στηλών.

2.7.2 Αναλυτική υπερφυγοκέντρηση

Σε αντίθεση με την προπαρασκευαστική φυγοκέντρηση, σκοπός της οποίας είναι ο διαχωρισμός ουσιών και ο καθαρισμός τους, η αναλυτική υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιείται κυρίως για τη μελέτη των ιδιοτήτων καθίζησης βιολογικών μακρομορίων και άλλων δομών. Επομένως, στην αναλυτική φυγοκέντρηση χρησιμοποιούνται ρότορες και συστήματα καταγραφής ειδικού σχεδιασμού: επιτρέπουν συνεχή παρακολούθηση της καθίζησης του υλικού Vφυγόκεντρο πεδίο.

Οι αναλυτικές υπερφυγόκεντρες μπορούν να φτάσουν ταχύτητες έως και 70.000 rpm -1, ενώ δημιουργούν φυγόκεντρη επιτάχυνση έως και 500.000 σολ . Ο ρότορας τους, κατά κανόνα, έχει το σχήμα ελλειψοειδούς και συνδέεται μέσω μιας χορδής σε έναν κινητήρα, ο οποίος σας επιτρέπει να μεταβάλλετε την ταχύτητα περιστροφής του ρότορα. Ο ρότορας περιστρέφεται σε θάλαμο κενού εξοπλισμένου με συσκευή ψύξης και έχει δύο κυψέλες, αναλυτική και εξισορροπητική, οι οποίες είναι εγκατεστημένες αυστηρά κάθετα στη φυγόκεντρο, παράλληλα με τον άξονα περιστροφής. Η κυψέλη εξισορρόπησης χρησιμεύει για την εξισορρόπηση της αναλυτικής κυψέλης και είναι ένα μεταλλικό μπλοκ με σύστημα ακριβείας. Διαθέτει επίσης δύο τρύπες δείκτη, που βρίσκονται σε αυστηρά καθορισμένη απόσταση από τον άξονα περιστροφής, με τη βοήθεια των οποίων προσδιορίζονται οι αντίστοιχες αποστάσεις στο αναλυτικό κελί. Το αναλυτικό κελί, του οποίου η χωρητικότητα είναι συνήθως 1 cm 3, έχει τομεακό σχήμα. Όταν τοποθετηθεί σωστά στον ρότορα, παρά το γεγονός ότι στέκεται κάθετα, λειτουργεί με την ίδια αρχή με έναν ρότορα με κρεμαστά κύπελλα, δημιουργώντας σχεδόν ιδανικές συνθήκες καθίζησης. Στα άκρα του αναλυτικού κελιού υπάρχουν παράθυρα με τζάμια χαλαζία. Οι αναλυτικές υπερφυγόκεντρες είναι εξοπλισμένες με οπτικά συστήματα που επιτρέπουν την παρατήρηση της καθίζησης σωματιδίων καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου φυγοκέντρησης. Σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα, το ιζηματοποιημένο υλικό μπορεί να φωτογραφηθεί. Κατά την κλασματοποίηση πρωτεϊνών και DNA, η καθίζηση παρακολουθείται με απορρόφηση στο υπεριώδες φως και σε περιπτώσεις όπου τα υπό μελέτη διαλύματα έχουν διαφορετικούς δείκτες διάθλασης, χρησιμοποιώντας σύστημα Schlieren ή σύστημα παρεμβολής Rayleigh. Οι δύο τελευταίες μέθοδοι βασίζονται στο γεγονός ότι όταν το φως διέρχεται από ένα διαφανές διάλυμα που αποτελείται από ζώνες με διαφορετικές πυκνότητες, η διάθλαση του φωτός συμβαίνει στο όριο των ζωνών. Κατά τη διάρκεια της καθίζησης, σχηματίζεται ένα όριο μεταξύ ζωνών με βαριά και ελαφρά σωματίδια, το οποίο λειτουργεί ως διαθλαστικός φακός. Σε αυτήν την περίπτωση, εμφανίζεται μια κορυφή στη φωτογραφική πλάκα που χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής. Κατά τη διάρκεια της καθίζησης, το όριο μετακινείται και, κατά συνέπεια, η κορυφή, με την ταχύτητα της οποίας μπορεί κανείς να κρίνει τον ρυθμό καθίζησης του υλικού. Τα συμβολομετρικά συστήματα είναι πιο ευαίσθητα από τα συστήματα Schlieren. Οι αναλυτικές κυψέλες είναι μονοτομείς, που χρησιμοποιούνται συχνότερα, και δύο τομέων, που χρησιμοποιούνται για τη συγκριτική μελέτη διαλύτη και διαλυμένης ουσίας.

Στη βιολογία, η αναλυτική υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των μοριακών βαρών των μακρομορίων, τον έλεγχο της καθαρότητας των δειγμάτων που προκύπτουν και επίσης για τη μελέτη διαμορφωτικών αλλαγών στα μακρομόρια.

2.8 Εφαρμογές αναλυτικής υπερφυγοκέντρησης

2.8.1 Προσδιορισμός μοριακών βαρών

Υπάρχουν τρεις κύριες μέθοδοι για τον προσδιορισμό των μοριακών βαρών χρησιμοποιώντας αναλυτική υπερφυγοκέντρηση: προσδιορισμός ρυθμού καθίζησης, μέθοδος ισορροπίας καθίζησης και μέθοδος προσέγγισης ισορροπίας καθίζησης.

Προσδιορισμός μοριακού βάρους με ρυθμό καθίζησης --αυτή είναι η πιο κοινή μέθοδος. Η φυγοκέντρηση πραγματοποιείται σε υψηλές ταχύτητες, έτσι ώστε τα σωματίδια, αρχικά ομοιόμορφα κατανεμημένα σε ολόκληρο τον όγκο, να αρχίσουν να κινούνται ομαλά κατά μήκος μιας ακτίνας από το κέντρο περιστροφής. Μια καθαρή διεπαφή σχηματίζεται μεταξύ της περιοχής του διαλύτη, που είναι ήδη απαλλαγμένη από σωματίδια, και του τμήματος που τα περιέχει. Αυτό το όριο μετακινείται κατά τη φυγοκέντρηση, γεγονός που καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό του ρυθμού καθίζησης των σωματιδίων χρησιμοποιώντας μία από τις παραπάνω μεθόδους, καταγράφοντας αυτή την κίνηση σε μια φωτογραφική πλάκα.

Ο ρυθμός καθίζησης καθορίζεται από την ακόλουθη σχέση:

Οπου Χ -- απόσταση από τον άξονα περιστροφής σε cm,

t -- χρόνος σε s,

w - γωνιακή ταχύτητα σε rad-s -1,

s είναι ο συντελεστής καθίζησης του μορίου.

Ο συντελεστής καθίζησης είναι η ταχύτητα ανά μονάδα επιτάχυνσης, μετριέται σε Μονάδες Seedberg ; 1 μονάδα Svedberg ισούται με 10_13 s. Η αριθμητική τιμή του s εξαρτάται από το μοριακό βάρος και το σχήμα των σωματιδίων και είναι μια τιμή χαρακτηριστική ενός δεδομένου μορίου ή υπερμοριακής δομής. Για παράδειγμα, ο συντελεστής καθίζησης της λυσοζύμης είναι 2,15 S. Το catal aza έχει συντελεστή καθίζησης 11,35S, οι βακτηριακές ριβοσωμικές υπομονάδες κυμαίνονται από 30 έως 50S και οι ευκαρυωτικές ριβοσωμικές υπομονάδες κυμαίνονται από 40 έως 60S.

Οπου Μ -- μοριακό βάρος του μορίου, R -- σταθερά αερίου, Τ -- απόλυτη θερμοκρασία, s -- συντελεστής καθίζησης μορίου, ρε -- συντελεστής διάχυσης του μορίου, v -- μερικός ειδικός όγκος, ο οποίος μπορεί να θεωρηθεί ως ο όγκος που καταλαμβάνει ένα γραμμάριο διαλυμένης ουσίας, p -- πυκνότητα του διαλύτη.

Μέθοδος ισορροπίας καθίζησης.Ο προσδιορισμός των μοριακών βαρών με αυτή τη μέθοδο πραγματοποιείται σε σχετικά χαμηλές ταχύτητες ρότορα, περίπου 7.000-8.000 rpm -1, έτσι ώστε μόρια με μεγάλο μοριακό βάρος να μην καθιζάνουν στον πυθμένα. Η υπερφυγοκέντρηση πραγματοποιείται έως ότου τα σωματίδια φτάσουν σε ισορροπία, η οποία δημιουργείται υπό την επίδραση των φυγόκεντρων δυνάμεων, αφενός, και των δυνάμεων διάχυσης, από την άλλη, δηλαδή μέχρι να σταματήσουν να κινούνται τα σωματίδια. Στη συνέχεια, από την προκύπτουσα βαθμίδα συγκέντρωσης, το μοριακό βάρος της ουσίας υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο

Οπου R -- σταθερά αερίου, Τ -- απόλυτη θερμοκρασία, ω -- γωνιακή ταχύτητα, p -- πυκνότητα διαλύτη, v -- μερικός ειδικός όγκος, Με Χ Και Με 2 -- συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας σε αποστάσεις σολ σολ και g 2 από τον άξονα περιστροφής.

Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι για να επιτευχθεί ισορροπία καθίζησης χρειάζεται πολύς χρόνος - από αρκετές ημέρες έως αρκετές εβδομάδες με συνεχή λειτουργία της φυγόκεντρου.

Η μέθοδος προσέγγισης της ισορροπίας καθίζησης αναπτύχθηκε για να απαλλαγούμε από τα μειονεκτήματα της προηγούμενης μεθόδου που σχετίζονται με τον μεγάλο χρόνο που απαιτείται για την επίτευξη ισορροπίας.Με αυτήν τη μέθοδο, τα μοριακά βάρη μπορούν να προσδιοριστούν όταν το φυγοκεντρημένο διάλυμα βρίσκεται σε κατάσταση πλησιάζει στην ισορροπία Πρώτα, τα μακρομόρια κατανέμονται ομοιόμορφα σε ολόκληρο τον όγκο του αναλυτικού κυττάρου· στη συνέχεια, καθώς προχωρά η φυγοκέντρηση, τα μόρια κατακάθονται και η πυκνότητα του διαλύματος στην περιοχή του μηνίσκου σταδιακά μειώνεται. Η αλλαγή στην πυκνότητα καταγράφεται προσεκτικά και, στη συνέχεια, μέσω πολύπλοκων υπολογισμών που περιλαμβάνουν μεγάλο αριθμό μεταβλητών, το μοριακό βάρος μιας δεδομένης ένωσης προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τους τύπους:

Οπου R -- σταθερά αερίου, Τ -- απόλυτη θερμοκρασία, v -- μερικός ειδικός όγκος, p - πυκνότητα διαλύτη, dcldr -- διαβάθμιση συγκέντρωσης του μακρομορίου, g m και g d -- απόσταση από τον μηνίσκο και τον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα, αντίστοιχα, s m και s d -- συγκέντρωση μακρομορίων στον μηνίσκο και στο κάτω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα, αντίστοιχα, Μ Μ Και Μ R -- Τιμές μοριακού βάρους που προσδιορίζονται από την κατανομή της συγκέντρωσης της ουσίας στον μηνίσκο και στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα, αντίστοιχα.

2.8.2 Αξιολόγηση της καθαρότητας του φαρμάκου

Η αναλυτική υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιείται ευρέως για την αξιολόγηση της καθαρότητας του DNA, του ιού και των πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων. Η καθαρότητα των παρασκευασμάτων είναι αναμφίβολα πολύ σημαντική σε περιπτώσεις που είναι απαραίτητος ο ακριβής προσδιορισμός του μοριακού βάρους ενός μορίου. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ομοιογένεια ενός παρασκευάσματος μπορεί να κριθεί από τη φύση του ορίου καθίζησης, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο προσδιορισμού του ρυθμού καθίζησης: ένα ομοιογενές παρασκεύασμα συνήθως δίνει ένα σαφώς καθορισμένο όριο. Οι ακαθαρσίες που υπάρχουν στο παρασκεύασμα εμφανίζονται ως πρόσθετη κορυφή ή ώμος. καθορίζουν επίσης την ασυμμετρία της κύριας κορυφής.

2.8.3 Μελέτη διαμορφωτικών αλλαγών σε μακρομόρια

Ένας άλλος τομέας εφαρμογής της αναλυτικής υπερφυγοκέντρησης είναι η μελέτη των διαμορφωτικών αλλαγών στα μακρομόρια. Ένα μόριο DNA, για παράδειγμα, μπορεί να είναι μονόκλωνο ή δίκλωνο, γραμμικό ή κυκλικό. Υπό την επίδραση διαφόρων ενώσεων ή σε υψηλές θερμοκρασίες, το DNA υφίσταται μια σειρά από αναστρέψιμες και μη αναστρέψιμες αλλαγές διαμόρφωσης, οι οποίες μπορούν να προσδιοριστούν από αλλαγές στον ρυθμό καθίζησης του δείγματος. Όσο πιο συμπαγές είναι το μόριο, τόσο χαμηλότερος είναι ο συντελεστής τριβής του στο διάλυμα και αντίστροφα: όσο λιγότερο συμπαγές είναι, τόσο μεγαλύτερος είναι ο συντελεστής τριβής και, επομένως, τόσο πιο αργά θα καθιζάνει. Έτσι, οι διαφορές στον ρυθμό καθίζησης ενός δείγματος πριν και μετά από διάφορες επιρροές σε αυτό καθιστούν δυνατό τον εντοπισμό διαμορφωτικών αλλαγών που συμβαίνουν στα μακρομόρια.

Σε αλλοστερικές πρωτεΐνες, όπως η ασπαρτική τρανσκαρβαμοϋλάση, συμβαίνουν αλλαγές διαμόρφωσης ως αποτέλεσμα της δέσμευσής τους στο υπόστρωμα και στους μικρούς υποκαταστάτες. Η διάσπαση της πρωτεΐνης σε υπομονάδες μπορεί να προκληθεί με την επεξεργασία της με ουσίες όπως η ουρία ή το παραχλωρομερκουρβενζοϊκό. Όλες αυτές οι αλλαγές μπορούν εύκολα να παρακολουθηθούν χρησιμοποιώντας αναλυτική υπερφυγοκέντρηση.

Παρόμοια έγγραφα

Χαρακτηριστικά της δομής και της ανάπτυξης των φυτικών κυττάρων. Μέθοδοι μελέτης φυτικών κυττάρων. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, δυνατότητες μικροσκοπίου φωτός. Μέθοδος Freeze-chip. Διαφορική φυγοκέντρηση, κλασματοποίηση. Μέθοδος κυτταροκαλλιέργειας.

περίληψη, προστέθηκε 06/04/2010

Απομόνωση εγκεφαλικών εγκεφαλικών εγκεφαλικών και σουλφατιδίων. Ποσοτικός προσδιορισμός των κλασμάτων ανά συστατικό υδατάνθρακα. Ειδική ραδιενέργεια μεμονωμένων κλασμάτων κερεμοσιδών και σουλφατιδίων. Προπαρασκευαστική παραγωγή σφιγγοσίνης. Μέθοδος περιοδικής οξείδωσης.

έκθεση, προστέθηκε 25/10/2014

Βασικοί μηχανισμοί κυτταρικής δραστηριότητας. Το κύτταρο ως μονάδα φυσιολογικών μεταβολικών διεργασιών. Βασικές ιδέες για τη ρύθμιση. Λειτουργίες κυτταρικών οργανιδίων, μεμβρανικά συστήματα ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Ανταλλαγή ουσιών μεταξύ του κυττάρου και του περιβάλλοντος.

παρουσίαση, προστέθηκε 02/04/2016

Σύνθεση της πρωτεΐνης Xvent-2 σε εμβρυϊκά κύτταρα με σκοπό την περαιτέρω διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων. Απομόνωση κυτταρικών οργανιδίων. Αντιδραστήρια και διαλύματα για ισοηλεκτρική εστίαση. Απόκτηση βιολογικού υλικού. Αποτελέσματα της εργασίας και η συζήτησή τους.

εργασία μαθήματος, προστέθηκε 27/06/2015

Η θέση του Σίτνικοφ στην τυπολογική ταξινόμηση. Διακριτικά χαρακτηριστικά των αγγειόσπερμων. Χαρακτηριστικά της δομής των κυττάρων, των ιστών και των υποκυτταρικών δομών. Οικότοπος της οικογένειας ορμώδους και χαρακτηριστικά αναπαραγωγής. Το μεγαλύτερο γένος της οικογένειας.

εργασία μαθήματος, προστέθηκε 10/10/2012

Ουσίες που αναστέλλουν τη βλάστηση από φρούτα και σπόρους και ο ρόλος τους στη διασπορά των φυτών. Εκκρίσεις ρίζας και ο ρόλος τους στην αλλοπάθεια. Η φύση των αλλελαπαθητικών δραστικών ουσιών. Φυσιολογική και βιοχημική δράση αλλοπαθητικά δραστικών ουσιών.

περίληψη, προστέθηκε 25/02/2016

Ο ιστός είναι ένα σύστημα ιδιωτικών οργάνων που αποτελείται από κύτταρα και εξωκυτταρικά στοιχεία με κοινή επιγονιδιωματική κληρονομικότητα. Εμβρυϊκή ιστογένεση: προσδιορισμός, πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, ολοκλήρωση και προσαρμογή κυτταρικών συστημάτων. Γενική ταξινόμηση υφασμάτων.

περίληψη, προστέθηκε 23/12/2012

Περιγραφή των κύριων λειτουργιών που εκτελούνται από τις διαδικασίες έκκρισης ουσιών στα φυτά. Η έννοια της αλλοπάθειας, της απέκκρισης και της έκκρισης. Λειτουργίες εξειδικευμένων εκκριτικών δομών στα φυτά. Ομάδες επιδερμικών σχηματισμών που εμπλέκονται στην έκκριση ουσιών.

παρουσίαση, προστέθηκε 15/03/2011

Ταξινόμηση ιστών, τύποι επιθηλιακών ιστών, δομή και λειτουργίες. Υποστηρικτική, τροφική και προστατευτική λειτουργία των συνδετικών ιστών. Λειτουργίες νευρικών και μυϊκών ιστών. Η έννοια των οργάνων και των συστημάτων οργάνων, οι ατομικές τους διαφορές, το φύλο, η ηλικία.

περίληψη, προστέθηκε 09/11/2009

Ιστορία της συστηματικής μελέτης των προτύπων εξέλιξης των ιστών. Θεωρία παραλληλισμού ιστολογικών δομών. Θεωρία αποκλίνουσας εξέλιξης ιστών. Θεωρία της Φυλεμβρυογένεσης στην Ιστολογία. Επιθηλιακά, μεσεγχυματικά παράγωγα, μυϊκός και νευρικός ιστός.